돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별
Summary
이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.
Abstract
생체 내에서 단백질 항상성을 이해하는 것은 세포가 생리적 및 질병 조건 모두에서 어떻게 작동하는지 아는 데 중요합니다. 본 프로토콜은 단백질 표지를 특정 세포 집단으로 향하게 하기 위해 조작된 마우스 라인을 사용하여 새로 합성된 단백질의 생체내 표지 및 후속 정제를 설명합니다. L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)의 Cre 재조합 효소 발현에 의한 유도성 라인으로, 그렇지 않으면 발생하지 않는 단백질에 아지도노르류신(ANL) 통합을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하여 생체 내에서 표지된 세포 유형 특이적 단백질체를 정제하고 샘플 복잡성 감소로 인한 단백질 함량의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.
Introduction
비정상적인 단백질 항상성은 단백질 합성 및 분해의 불균형으로 인해 발생합니다. 여러 질병은 단백질 항상성의 변화와 관련이 있습니다. 일부 질병의 특징은 다른 세포 하 위치와 뇌 영역에 응집체가 존재한다는 것입니다. 단백질 항상성은 질병에서 중요할 뿐만 아니라 정상 장기 및세포 기능에도 중요한 역할을 합니다1. 예를 들어, 단백질 합성은 단백질 합성을 차단하는 화학적 억제제의 사용에 의해 결정되는 바와 같이 많은 형태의 신경 가소성 2,3에 필요합니다4. 그러나 학습과 기억을 지원하기 위해 프로테옴이 어떤 세포 유형에서 변경되는지, 각 세포 유형의 특정 단백질이 합성 또는 분해에서 증가 또는 감소하는지 명확하지 않습니다. 따라서 단백질 항상성에 대한 포괄적 인 연구는 특정 세포 유형에서 오는 단백질체를 구별 할 수있는 능력을 필요로합니다. 실제로, 다세포 환경에서 발생하는 세포 과정을 연구하기 위한 세포 유형 특이적 단백질체의 식별은 단백질체학에서 중요한 장애물이었습니다. 이러한 이유로 당사는 세포 유형 특이적 단백질체를 식별하고 정제하는 효과적인 방법으로 입증된 생체 직교 방법과 결합된 MetRS* 발현을 사용하여 이 격차를 메우는 기술을 개발했습니다 5,6,7.
돌연변이 MetRS*(MetRS L274G)의 발현은 비-정준 메티오닌 유사체 ANL을 상응하는 tRNA 8,9 내로 로딩하고 이후 단백질에 혼입시킬 수 있게 한다. MetRS* 발현이 세포 유형 특이적 프로모터에 의해 조절되는 경우, 비표준 아미노산은 세포 선택적인 방식으로 단백질에 통합됩니다. 일단 ANL이 단백질에 통합되면, 클릭 화학에 의해 선택적으로 기능화 될 수 있으며, 이어서 이미징 (FUNCAT) 또는 웨스턴 면역 블롯 (BONCAT)에 의해 시각화 될 수있다. 대안적으로, 단백질은 선택적으로 정제되고 질량 분석법 (MS)에 의해 확인 될 수있다. 이 기술을 사용하여 Cre 재조합 효소의 제어하에 MetRS* 단백질을 발현하는 마우스 라인을 만들었습니다. 사용 가능한 Cre-mouse 라인의 수가 증가함에 따라 MetRS* 시스템은 모든 분야에서 기존 Cre-라인이 있는 모든 조직의 모든 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. ANL을 사용한 단백질 표지는 시험관 내 또는 생체 내에서 가능하며 마우스 행동 또는 단백질 무결성을 변경하지 않습니다6. 라벨링 기간은 각 연구자의 과학적 질문에 맞게 조정할 수 있으며, 새로 합성 된 단백질 (라벨링 시간 단축) 또는 전체 프로테옴 (라벨링 시간 단축)을 라벨링합니다. 이 기술의 사용은 연구자가 연구하고자하는 유형의 세포 수에 의해 제한됩니다. 따라서 이 방법으로는 숫자가 적거나 대사율이 낮은 세포 유형에서 단백질을 분리할 수 없습니다. 제시된 방법의 목표는 생체 내에서 표지된 세포 유형 특이적 단백질/프로테옴을 식별하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 살아있는 마우스에서 ANL로 세포 유형 특이적 단백질체를 표지하고 표지된 단백질을 정제하는 방법을 설명합니다. 정제 후, 단백질은 일상적인 질량 분석 프로토콜 5,10에 의해 확인될 수 있다. 특정 세포 집단에서 단백질을 선택적으로 정제하여 이 방법에서 달성한 샘플 복잡성의 감소는 실험자가 예를 들어 환경 변화에 대한 반응으로 프로테옴의 미묘한 변화를 감지할 수 있도록 합니다. 표지된 단백질의 정제는 MS 분석 또는 표지 기간을 포함하지 않고 ~10일 내에 달성할 수 있습니다. 여기에서는 MetRS* 발현 마우스에 ANL을 투여하는 두 가지 방법, 즉 (1) 음용수에 아미노산을 첨가하는 방법과 (2) 복강 주사로 ANL을 도입하는 방법에 대해 설명합니다. ANL 투여를 위해 선택된 방법에 관계없이, 단리 및 정제 단계는 동일하다(단계 2부터).
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 중요한 측면은 다음과 같습니다. DST- 알킨을 사용할 때 충분한 생물학적 복제, ANL 투여 경로, 양 및 기간, 샘플의 알킬화, 알킨 농도 및 β- 메르 캅토 에탄올 제거를 갖는 음성 대조군의 포함.
Cre 드라이버가 없는 ANL 표지 동물에서 진행된 음성 대조군 샘플을 포함하는 것이 중요하므로 MetRS* 발현이 없습니다. 이러한 샘플은 ANL 표지 Cre 유도 MetRS* 마우스의 샘플과 병?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BAC는 스페인 과학 혁신부(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), 마드리드 자치 커뮤니티(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) 및 MICINN(PID2020-113270RA-I00) 보조금의 지원을 받습니다. R. A-P는 마드리드 자치 공동체 (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)의 자금 지원을 받고 있습니다. E.M.S.는 막스 플랑크 협회, 유럽 연구위원회 (보조금 743216), DFG CRC 1080 : 신경 항상성의 분자 및 세포 메커니즘 및 DFG CRC 902 : RNA 기반 조절의 분자 원리. D.C Dieterich와 P. Landgraf의 기술적 조언과 DST-Alkyne의 합성에 감사드립니다. E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast 및 MPI for Brain Research의 동물 시설에 감사드립니다. Nex-Cre 마우스 라인을 공유해 주신 Sandra Goebbels에게 감사드립니다. 영어 편집에 도움을 주신 Antonio G. Carroggio에게 감사드립니다. 학사 실험을 설계, 수행 및 분석했습니다. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. 및 S. T. D. 실험을 수행하고 분석했습니다. BAC와 E.M.S.는 실험을 설계하고 프로젝트를 감독했으며 BAC는 논문을 썼습니다. 모든 저자가 논문을 편집했습니다.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
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