Celletypespecifik proteinrensning og identifikation fra komplekse væv ved hjælp af en mutant methionin tRNA-syntetasemuselinje
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører celletypespecifik proteinmærkning med azidonorleucin (ANL) ved hjælp af en muselinje, der udtrykker en mutant L274G-methionin tRNA-syntetase (MetRS *) og de nødvendige trin til mærkning af celletypespecifikke proteiner. Vi skitserer to mulige ANL-administrationsveje i levende mus ved (1) drikkevand og (2) intraperitoneale injektioner.
Abstract
At forstå proteinhomeostase in vivo er nøglen til at vide, hvordan cellerne fungerer under både fysiologiske og sygdomsforhold. Den nuværende protokol beskriver in vivo-mærkning og efterfølgende oprensning af nyligt syntetiserede proteiner ved hjælp af en konstrueret muselinje til direkte proteinmærkning til specifikke cellulære populationer. Det er en inducerbar linje ved Cre-rekombinaseekspression af L274G-methionin tRNA-syntetase (MetRS*), hvilket muliggør azidonorleucin (ANL) inkorporering i proteinerne, som ellers ikke vil forekomme. Ved hjælp af den metode, der er beskrevet her, er det muligt at rense celletypespecifikke proteomer mærket in vivo og detektere subtile ændringer i proteinindholdet på grund af reduktion af prøvekompleksitet.
Introduction
Afvigende protein homeostase er forårsaget af en ubalance i proteinsyntese og nedbrydning. Flere sygdomme er relateret til ændringer i proteinhomeostase. Kendetegnende for nogle sygdomme er tilstedeværelsen af aggregater i forskellige subcellulære steder og hjerneområder. Protein homeostase er ikke kun vigtig i sygdom, men spiller også en afgørende rolle i normal organ og cellulær funktion1. For eksempel er proteinsyntese nødvendig for mange former for neuronal plasticitet2,3, som bestemt ved anvendelse af kemiske hæmmere, der blokerer proteinsyntese4. Det er imidlertid hverken klart, i hvilke celletyper proteomet ændres for at understøtte læring og hukommelse, og det forstås heller ikke, hvilke specifikke proteiner i hver celletype der øges eller falder i deres syntese eller nedbrydning. Således kræver en omfattende undersøgelse af proteinhomeostase evnen til at differentiere proteomer, der kommer fra specifikke celletyper. Faktisk har identifikationen af celletypespecifikke proteomer til undersøgelse af cellulære processer, der forekommer i et flercellet miljø, været en vigtig hindring i proteomics. Af denne grund udviklede vi en teknik ved hjælp af MetRS * -udtryk kombineret med bioortogonale metoder, der har vist sig at være en effektiv måde at identificere og rense celletypespecifikke proteomer og udfylde dette hul 5,6,7.
Ekspressionen af en mutant MetRS* (MetRS L274G) gør det muligt at indlæse den ikke-kanoniske methioninanalog ANL i det tilsvarende tRNA 8,9 og dets efterfølgende inkorporering i proteiner. Når MetRS*-ekspression reguleres af en celletypespecifik promotor, vil den ikke-kanoniske aminosyre blive inkorporeret i proteinerne på en celleselektiv måde. Når ANL er inkorporeret i proteinerne, kan det selektivt funktionaliseres ved klikkemi og efterfølgende enten visualiseres ved billeddannelse (FUNCAT) eller ved Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt oprenses og identificeres ved massespektrometri (MS). Ved hjælp af denne teknologi skabte vi en muselinje, der udtrykker MetRS*-proteinet under kontrol af Cre-rekombinasen. I betragtning af det stigende antal tilgængelige Cre-mus-linjer kan MetRS*-systemet bruges i ethvert felt til at studere enhver celletype fra ethvert væv, for hvilket der er en eksisterende Cre-line. Proteinmærkning med ANL er mulig in vitro eller in vivo og ændrer ikke musens adfærd eller proteinintegritet6. Mærkning af tidsperiode kan tilpasses det videnskabelige spørgsmål for hver forsker, mærkning af nyligt syntetiserede proteiner (kortere mærkningstider) eller hele proteomer (længere mærkningstider). Brugen af denne teknik er begrænset af antallet af celler af den type, som forskeren er villig til at studere; derfor er proteinisolering fra celletyper med lavt antal eller lave stofskifter ikke mulig ved denne metode. Målet med den præsenterede metode er at identificere celletypespecifikke proteiner/proteomer mærket in vivo. I denne protokol beskriver vi, hvordan man mærker celletypespecifikke proteomer med ANL i levende mus og renser de mærkede proteiner. Efter oprensning kan proteiner identificeres ved rutinemæssige massespektrometriprotokoller 5,10. Reduktionen af prøvekompleksitet opnået i denne metode ved selektiv oprensning af proteiner fra specifikke cellulære populationer gør det muligt for eksperimentatoren at detektere subtile ændringer i proteomer, for eksempel som reaktion på miljøændringer. Oprensning af de mærkede proteiner kan opnås på ~ 10 dage, ikke inklusive MS-analysen eller mærkningsperioden. Her beskriver vi to metoder til ANL-administration til MetRS*-ekspressive mus, nemlig (1) tilsætning af aminosyren i drikkevandet og (2) introduktion af ANL ved intraperitoneale injektioner. Uanset hvilken metode der er valgt til ANL-administration, er isolerings- og rensningstrinnene de samme (fra trin 2 og frem).
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiske aspekter af protokollen er; inkludering af negative kontroller, der har tilstrækkelige biologiske replikater, ANL-administrationsvej, mængde og varighed, alkylering af prøverne, alkynkoncentration og eliminering af β-mercaptoethanol ved anvendelse af DST-alkyn.
Det er vigtigt at inkludere negative kontrolprøver, der stammer fra ANL-mærkede dyr uden Cre-driver og derfor ingen MetRS *-udtryk. Disse prøver skal underkastes hvert trin, der er beskrevet i protokollen, parallelt m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C finansieres af det spanske ministerium for videnskab og innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), af den selvstyrende region Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) og MICINN (PID2020-113270RA-I00) tilskud. R. A-P er finansieret af den selvstyrende region Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. er finansieret af Max Planck Society, en Advanced Investigator-pris fra Det Europæiske Forskningsråd (bevilling 743216), DFG CRC 1080: Molekylære og cellulære mekanismer af neural homeostase og DFG CRC 902: Molekylære principper for RNA-baseret regulering. Vi takker D.C Dieterich og P. Landgraf for deres tekniske rådgivning og syntesen af DST-Alkyne. Vi takker E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast og MPI’s dyrefacilitet for hjerneforskning for deres fremragende støtte. Vi takker Sandra Goebbels for at dele Nex-Cre muselinjen. Vi takker Antonio G. Carroggio for hans hjælp med engelsk redigering. B.A-C. designet, udført og analyseret eksperimenter. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. og S. t. D. udførte og analyserede eksperimenter. B.A-C og E.M.S. designede eksperimenter og overvågede projektet, skrev B.A-C papiret. Alle forfattere redigerede papiret.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
