Celltypspecifik proteinrening och identifiering från komplexa vävnader med hjälp av en mutant metionin tRNA-syntetasmuslinje
Summary
Detta protokoll beskriver hur man utför celltypspecifik proteinmärkning med azidonorleucin (ANL) med hjälp av en muslinje som uttrycker ett mutant L274G-metionin-tRNA-syntetas (MetRS*) och de nödvändiga stegen för märkt celltypspecifik proteinisolering. Vi beskriver två möjliga ANL-administreringsvägar i levande möss med (1) dricksvatten och (2) intraperitoneala injektioner.
Abstract
Att förstå proteinhomeostas in vivo är nyckeln till att veta hur cellerna fungerar i både fysiologiska och sjukdomstillstånd. Detta protokoll beskriver in vivo-märkning och efterföljande rening av nyligen syntetiserade proteiner med hjälp av en konstruerad muslinje för att rikta proteinmärkning till specifika cellulära populationer. Det är en inducerbar linje genom Cre-rekombinasuttryck av L274G-metionintRNA-syntetas (MetRS*), vilket möjliggör azidonorleucin (ANL) införlivande till proteinerna, vilket annars inte kommer att inträffa. Med hjälp av den metod som beskrivs här är det möjligt att rena celltypspecifika proteomer märkta in vivo och detektera subtila förändringar i proteininnehållet på grund av provkomplexitetsreduktion.
Introduction
Avvikande proteinhomeostas orsakas av en obalans i proteinsyntes och nedbrytning. Flera sjukdomar är relaterade till förändringar i proteinhomeostas. Kännetecknet för vissa sjukdomar är närvaron av aggregat i olika subcellulära platser och hjärnområden. Proteinhomeostas är inte bara viktigt vid sjukdom utan spelar också en avgörande roll i normal organ- och cellulär funktion1. Till exempel är proteinsyntes nödvändig för många former av neuronal plasticitet2,3, vilket bestäms av användningen av kemiska hämmare som blockerar proteinsyntes4. Det är emellertid varken klart i vilka celltyper proteomet förändras för att stödja inlärning och minne, och det är inte heller förstått vilka specifika proteiner i varje celltyp som ökar eller minskar deras syntes eller nedbrytning. Således kräver en omfattande studie av proteinhomeostas förmågan att differentiera proteomer som kommer från specifika celltyper. Faktum är att identifieringen av celltypspecifika proteomer för att studera cellulära processer som förekommer i en flercellig miljö har varit ett viktigt hinder i proteomik. Av denna anledning utvecklade vi en teknik med MetRS*-uttryck i kombination med bio-ortogonala metoder som har visat sig vara ett effektivt sätt att identifiera och rena cellspecifika proteomer och fylla detta gap 5,6,7.
Uttrycket av en mutant MetRS* (MetRS L274G) möjliggör laddning av den icke-kanoniska metioninanalogen ANL i motsvarande tRNA 8,9 och dess efterföljande införlivande i proteiner. När MetRS*-uttryck regleras av en celltypspecifik promotor kommer den icke-kanoniska aminosyran att införlivas i proteinerna på ett cellselektivt sätt. När ANL har införlivats i proteinerna kan det selektivt funktionaliseras genom klickkemi och därefter antingen visualiseras genom avbildning (FUNCAT) eller genom Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt renas och identifieras med masspektrometri (MS). Med hjälp av denna teknik skapade vi en muslinje som uttrycker MetRS*-proteinet under kontroll av Cre-rekombinaset. Med tanke på det ökande antalet tillgängliga Cre-mouse-linjer kan MetRS*-systemet användas inom vilket område som helst för att studera vilken celltyp som helst från vilken vävnad som helst för vilken det finns en befintlig Cre-line. Proteinmärkning med ANL är möjlig in vitro eller in vivo och förändrar inte musens beteende eller proteinintegritet6. Märkningstidsspann kan anpassas till den vetenskapliga frågan för varje forskare, märkning av nyligen syntetiserade proteiner (kortare märkningstider) eller hela proteomer (längre märkningstider). Användningen av denna teknik begränsas av antalet celler av den typ som forskaren är villig att studera; därför är proteinisolering från celltyper med lågt antal eller låga metaboliska hastigheter inte möjlig med denna metod. Målet med den presenterade metoden är att identifiera celltypsspecifika proteiner/proteomer märkta in vivo. I detta protokoll beskriver vi hur man märker celltypspecifika proteom med ANL i levande möss och renar de märkta proteinerna. Efter rening kan proteiner identifieras med hjälp av rutinmässiga masspektrometriprotokoll 5,10. Minskningen av provkomplexiteten som uppnås i denna metod genom selektiv rening av proteiner från specifika cellulära populationer gör det möjligt för experimentet att detektera subtila förändringar i proteomer, till exempel som svar på miljöförändringar. Rening av de märkta proteinerna kan uppnås på ~ 10 dagar, exklusive MS-analysen eller märkningsperioden. Här beskriver vi två metoder för ANL-administrering till MetRS*-uttryckande möss, nämligen (1) tillsats av aminosyran i dricksvattnet och (2) införande av ANL genom intraperitoneala injektioner. Oavsett vilken metod som valts för administrering av ANL är isolerings- och reningsstegen desamma (från steg 2 och framåt).
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiska aspekterna av protokollet är; Införande av negativa kontroller, med tillräckligt med biologiska replikat, administreringsväg för ANL, mängd och varaktighet, alkylering av proverna, alkynkoncentration och eliminering av β-merkaptoetanol vid användning av DST-alkyn.
Det är viktigt att inkludera negativa kontrollprover från ANL-märkta djur utan Cre-drivrutin och därför inget MetRS*-uttryck. Dessa prover måste utsättas för varje steg som beskrivs i protokollet parallell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C finansieras av det spanska ministeriet för vetenskap och innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), av den autonoma regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) och MICINN (PID2020-113270RA-I00) bidrag. R. A-P finansieras av den autonoma regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. finansieras av Max Planck Society, ett Advanced Investigator-pris från European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis och DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Vi tackar D.C Dieterich och P. Landgraf för deras tekniska råd och syntesen av DST-Alkyne. Vi tackar E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast och djuranläggningen för MPI for Brain Research för deras utmärkta stöd. Vi tackar Sandra Goebbels för att hon delade Nex-Cre-muslinjen. Vi tackar Antonio G. Carroggio för hans hjälp med engelsk redigering. B.A-C. designade, genomförde och analyserade experiment. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. och S. t. D. genomförde och analyserade experiment. B.A-C och E.M.S. designade experiment och övervakade projektet, B.A-C skrev tidningen. Alla författare redigerade tidningen.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
