Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Camille M. Selvais; Laura L. De Cock; Sonia M. Brichard; Mar&#237;a A. Davis-L&#243;pez de Carrizosa

doi:10.3791/63718

JoVE Journal > Medicine

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Medicine

骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

Published: June 08, 2022

doi:

10.3791/63718

Camille M. Selvais, Laura L. De Cock, Sonia M. Brichard, María A. Davis-López de Carrizosa²

¹Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector,Université Catholique de Louvain, ²Departamento de Fisiología, Facultad de Biología,Universidad de Sevilla

Summary

増加する証拠は、骨格筋内の脂質の過剰な浸潤が脂肪毒性および糖尿病をもたらすことを示している。ここでは、線維型特異的な方法で脂肪滴のサイズ、密度、および細胞内分布を定量化するために、組織処理、Bodipyによる染色、画像取得、および分析を含む完全なプロトコルを提示する。

Abstract

筋症として知られている骨格筋脂質浸潤は、肥満および老化とともに増加する。筋症はまた、心血管疾患および癌のようないくつかの他の障害のための負の予後因子として最近発見されている。過剰な脂質浸潤は筋肉量と強度を低下させます。それはまた、総筋細胞内脂質含量、脂肪滴(LD)形態、および細胞内分布に依存して脂肪毒性およびインスリン抵抗性をもたらす。酸化繊維は脂質を利用する能力が大きいため、繊維タイプ(酸化性対解糖系)も重要です。病態生理学におけるそれらの決定的な意味合いのために、LDのダイナミクスおよび繊維タイプ特異的な方法での機能に関する詳細な研究が正当化される。

本明細書では、筋細胞内脂質含量の定量化およびLD形態および細胞内分布の分析をファイバータイプ特異的な様式で分析するための完全なプロトコールが提示される。この目的のために、連続筋凍結切片を、蛍光色素Bodipyおよびミオシン重鎖アイソフォームに対する抗体で染色した。このプロトコルは、異なる筋肉の同時処理を可能にし、時間を節約し、可能性のあるアーチファクトを回避し、フィジーで作成されたパーソナライズされたマクロのおかげで、LD分析の自動化も可能です。

Introduction

筋症として知られている骨格筋脂質浸潤は、肥満および老化とともに増加する。筋症は、筋肉量および強度およびインスリン感受性¹と負の相関がある。さらに、最近の研究は、筋食症の程度が心血管疾患²、非アルコール性脂肪性肝疾患³、または癌⁴などの他の状態の予後因子として使用できることを示している。脂質は、筋細胞外脂質として、または筋線維内の骨格筋に筋細胞内脂質(IMCL)として蓄積することができる。IMCLsは、主に脂肪滴(LD)中のトリグリセリドとして貯蔵され、身体運動中に代謝燃料として使用される^5,6。しかし、脂質供給が需要を上回ったり、ミトコンドリアが機能不全になったりすると、IMCLは代謝的に不健康な肥満の個人や2型糖尿病患者に見られるように、筋肉インスリン抵抗性に関与し^ます7。興味深いことに、持久力アスリートは、高いインスリン感受性を維持しながら、2型糖尿病の肥満患者に見られるものと同様のレベルのIMCLを有する。この現象は「アスリートのパラドックス」^8,9として記述され、筋肉LDのサイズ、密度、局在化、動態、脂質種の組成に関連する筋肉LDのより微妙な評価によって説明される。

第1に、LDサイズはインスリン感受性および体力に反比例する¹⁰^、¹¹。実際、より小さいLDは、リパーゼ作用に対して比較的大きな表面積を示し、したがって、潜在的に、脂質¹²を動員するより大きな能力を有する。第二に、LD密度(数/表面)は、インスリン作用において物議を醸す役割を果たしている^8,10;しかし、アスリートでは増えているようです。第3に、表面膜のすぐ下に位置するLDs(サルコレマール下または末梢)は、中心膜よりもインスリン感受性に対してより有害な影響を及ぼすので、LDの細胞内局在化は重要である⁸、⁹^、¹³。後者は、より大きな呼吸活動を有し、収縮に必要な高いエネルギー需要を満たすためにより専門化された中枢ミトコンドリアに燃料を供給する¹⁴。対照的に、末梢LDは、膜関連プロセスに関与するサルコレンマル下ミトコンドリアを供給する⁸。最後に、トリグリセリドを超えて、筋肉内の特定の複合脂質は、他の脂質よりも有害であり得る。例えば、ジアシルグリセロール、長鎖アシルCoA、およびセラミドは、トリグリセリドの代謝回転率が低いときに筋肉に蓄積し、それによってインスリンシグナル伝達^を損なう9^、¹⁵。「アスリートのパラドックス」に戻ると、持久力アスリートはI型(酸化)線維において高い回転率を有する多数のより小さな中枢LDを有するが、肥満および糖尿病患者は、II型(解糖系)線維において低いターンオーバー率を有するより大きな末梢LDを有する^8,15,16。エネルギー貯蔵および放出におけるそれらの役割に加えて、誘導脂肪酸(FA)およびコートタンパク質(ペリリピン5)を介したLDは、FA酸化およびミトコンドリア生合成の転写調節に関与する重要なプレーヤーとしても機能し得る⁸。生理学および病態生理学におけるそれらの決定的な意味合いのために、LDsのダイナミクスおよび機能に関する詳細な研究が正当化される。

IMCLを研究するにはいくつかの手法がありますが、繊維固有の方法でLDのサイズ、密度、および分布を正確に定量化するのには適していません。例えば、磁気共鳴分光法によるIMCLの評価は、非侵襲的でありながら、繊維内のLDのサイズおよび正確な位置を研究するのに十分ではないレベルの分解能を提供し、繊維タイプ特異的ではない^17,18。同様に、全筋ホモジネート¹⁹に対して行われる生化学的技術は、脂質の位置およびサイズを評価することができない。したがって、LDの形態および位置を分析するための最も適切な方法は、定量的透過電子顕微鏡¹³であるが、この技術は高価で時間がかかる。したがって、オイルレッドO(ORO)20,21、モノダンシルペンタン(MDH)²²、またはボディ^{ピー23,24,25}などの色素を含む調製物に対する共焦点蛍光イメージングは、これらの研究のための最良のツールとして浮上している。

ここでは、組織サンプリングと処理、ボディ染色、共焦点画像の取得と分析を含む完全なプロトコルが説明され、マウス筋肉凍結切片におけるLDのサイズ、数、および局在を定量化します。IMCLは酸化性繊維と解糖系繊維の間で均等に分布しておらず、各繊維タイプはLDダイナミクスを異なる方法で調節するので、IMCLの研究は繊維タイプ特異的でなければならない^16,25,26,27。したがって、このプロトコルは、シリアルセクションの免疫蛍光を使用して、各ファイバーによって発現されるミオシン重鎖(MyHC)アイソフォームを同定します。このプロトコルのもう1つの利点は、解糖系(伸筋デジトルムロンガス、EDL)と酸化的(ヒラメ)筋肉を同時に処理して凍結前に並べて配置することです(図1)。この同時処理により、時間を節約できるだけでなく、サンプルの個別の処理による変動も回避されます。

図1:手順の概略概要筋肉解剖(1)後、類似の大きさの選択された筋肉が調製され、一緒に凍結される(2)。10μmの連続横切片は、クライオスタットを使用して得られ、接着スライドに直接取り付けられる(3)。2つの連続スライドから、第1の(4A)はラミニンについて免疫標識され、LDを認識するためにボディピーで染色され、第2の(4B)は筋線維タイプの認識のためにMyHCに対する抗体で免疫染色される。画像は、ボディピーの共焦点顕微鏡(5A)および筋線維タイプの落射蛍光顕微鏡(5B)を使用して取得される。フィジーでは、閾値を適用し、粒子(6A)を定量化して、LD(7)または計数細胞(6B)が占める総面積の数、平均サイズ、密度、および割合を取得して、セクション(7)内の各タイプの繊維の割合を得ることによって、画像が分析されます。略語: LDs = 脂肪滴;EDL = 伸筋デジトーラム・ロンガス;MyHCs=ミオシン重鎖アイソフォーム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

マウスに対して実施されたすべての手順は、ルーヴァン・カトリック大学の医学部門の動物実験倫理委員会によって承認されました(2019/UCL/MD/013)。 1. 凍結用試料の解剖・調製筋肉の各ペアに厚さ3mmのコルク片にラベルを付けます。コルクの中央に刃先で作った小さな切開部を通して、支持体となる長方形の硬質プラスチック片(0.5 cm W、1 cm H)?…

Representative Results

本明細書に記載されるプロトコルは、ファイバータイプおよびサブセルラー特異的な様式でLDsを容易に定量するための効率的な方法を提供する。EDLとヒラメなどの同様のサイズの2つの筋肉を一緒に凍結することによって、次のステップに費やされる時間とリソースが半分に減少する方法を示しています。免疫染色、画像取得、および成体マウスの筋肉で発現するさまざ?…

Discussion

ここで詳述するプロトコルは、繊維タイプおよびサブセルラー特異的にBodipyでタグ付けされたLDを定量する効率的な方法を説明しています。近年、OROやスーダンブラックBなどの古典的な脂質色素は、中性脂質に結合する細胞透過性、親油性、蛍光色素(例えば、Bodipy)の新しい配列で置き換えられています。異なるコンジュゲートとして利用可能なBodipyは、異なる固定組織および細胞23、<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は 、Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20)と Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care)からの助成金によって支援されました。M.A.D.-L.d.C.はワロニー・ブリュッセル国際エクセレンス・プログラムからフェローシップを受けました。

著者らは、このプロトコルの開発に貢献したアリス・モニエと、画像取得プロセスにおける彼女の専門知識と技術的支援に対してキャロライン・ブーザンに感謝します。我々はまた、クライオスタット及び顕微鏡へのアクセスについて、2IP-IRECイメージングプラットフォーム(2IP-IRECイメージングプラットフォーム、実験臨床研究所、ルーヴァンカトリック大学、1200ブリュッセル、ベルギー)にも感謝する。最後に、著者らは、原稿の建設的な批判に対して、ニコラ・デュビュイソン、ロマン・ヴェルセル、ミシェル・アブー=サムラに感謝したい。これらの記事の数字のいくつかは、BioRender.com で作成されました。

Materials

Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera	Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera	Zeiss
Chemical hood	Potteau Labo	EN-14175
Confocal microscope	Zeiss	LSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick)	Electron Microscopy Sciences	63305
Cryo-Gloves	Tempshield	16072252
Cryostat	Thermo Scientific	Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745	Nikon
Dry Ice
Dumont Forceps	F.S.T	11295-10
Epifluorescence microscope	Zeiss	AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T	14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm)	ThermoFisher	22-363-552	Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	BRAND Petri dish, MERK	BR455751	Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen	Vector Labs	H-4000	Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
Incubator	MMM Medcenter	Incucell 707
Microscope Cover Glasses (24×50 mm)	Assistent	40990151
Microscope Slide Boxes	Kartell	278	Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holder	Linie zwo	SB-035X-02	Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade	Swann-Morton	0205
Paint brushes	Van Bleiswijck	Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Permanent Marker Pen Black	Klinipath/VWR	98307-R	Used to label slides
Pierce Fixation Forceps	F.S.T	18155-13
Polystyrene Box			H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3	Aesculap	BB073R
Stainless Steel Cup 10oz	Eboxer	B07GFCBPFH	Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slides	ThermoFisher	J1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teeth	Medische Vakhandel	1303152	Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors – 3 mm Cutting Edge	F.S.T	15000-00
Weighing boats	VWR international	611-2249
Whole-Slide Scanner for Fluorescence	Zeiss	Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b	Sigma-Aldrich	SAB4600477	Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1	ThermoFisher	A-21121	Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM	Abcam	ab175702	Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher	A-21247	Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)	ThermoFisher	D3922	Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)	ThermoFisher	D3835	Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306	Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8418	Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	1004969011	CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPur	VWR international	24872.298	CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid Nitrogen			CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent	Vector Labs	MKB-2213-1	Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b	DSHB University of Iowa	BA-D5-supernatant	Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1	DSHB University of Iowa	SC-71-supernatant	Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM	Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa	6H1-supernatant	Used at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS)	Vector Labs	S-1000
PBS 0.1 M			Commonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal)	Sigma-Aldrich	L0663	Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Software
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.		Used to design the figures
Adobe Photoshop	Adobe Inc.		Confocal software
BioRender	https://biorender.com/		Used to design the figures
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/		Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPoint	Microsoft		Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6	Zeiss		Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

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