Методы микроскопии для интерпретации грибковой колонизации в микогетеротрофных тканях растений и симбиотической прорастания семян

Summary

Этот протокол направлен на обеспечение подробных процедур сбора, фиксации и поддержания микогетеротрофных образцов растений, применяя различные методы микроскопии, такие как сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия, световая, конфокальная и флуоресцентная микроскопия для изучения грибковой колонизации в тканях растений и семенах, прорастающих микоризными грибами.

Abstract

Структурная ботаника является незаменимой перспективой для полного понимания экологии, физиологии, развития и эволюции растений. При исследовании микогетеротрофных растений (то есть растений, которые получают углерод из грибов) замечательные аспекты их структурных адаптаций, закономерности колонизации тканей грибами и морфоанатомия подземных органов могут просветить их стратегии развития и их отношения с гифами, источником питательных веществ. Еще одна важная роль симбиотических грибов связана с прорастанием семян орхидеи; все виды Orchidaceae являются микогетеротрофными на стадии прорастания и рассады (начальная микогетеротрофия), даже те, которые фотосинтезируют на взрослых стадиях. Из-за отсутствия питательных запасов в семенах орхидей грибковые симбионты необходимы для обеспечения субстратов и обеспечения прорастания. Анализ стадий прорастания по структурным перспективам также может ответить на важные вопросы, касающиеся взаимодействия грибов с семенами. Различные методы визуализации могут быть применены для выявления эндофитов грибов в тканях растений, как предлагается в этой статье. От руки и тонкие участки органов растений можно окрашивать, а затем наблюдать с помощью световой микроскопии. Фторхром, конъюгированный с агглютинином зародышей пшеницы, может быть применен к грибам и инкубирован совместно с Calcofluor White для выделения клеточных стенок растений в конфокальной микроскопии. Кроме того, подробно описаны методологии сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии для микогетеротрофных орхидей, а также исследуются возможности применения таких протоколов в родственных растениях. Симбиотическое прорастание семян орхидеи (т.е. в присутствии микоризных грибов) подробно описано в протоколе, наряду с возможностями подготовки структур, полученных с разных стадий прорастания, для анализов с помощью световой, конфокальной и электронной микроскопии.

Introduction

Структурные исследования в ботанике, охватывающие морфологию и анатомию растений, являются базовыми для понимания всего организма ^1,2 и обеспечивают необходимые перспективы для интеграции и внесения вклада в знания об экологии, физиологии, развитии и эволюции растений³. Методы в морфологии и анатомии растений в настоящее время включают протоколы, оборудование и знания, разработанные недавно, а также более века назад². Непрерывное выполнение и адаптация классических методов (например, световая микроскопия) наряду с более современными методами (например, конфокальной микроскопией, рентгеновской микротомографией) имеют одну и ту же существенную основу: теоретические знания, позволяющие разрабатывать методологию.

Основным инструментом в анатомии и морфологии растений является изображение. Несмотря на ошибочное представление о том, что такие анализы являются простыми наблюдениями, давая пространство субъективным интерпретациям², анализ и понимание изображений в этой области требует знания применяемых методов (оборудование, тип анализа, методологические процедуры), клеточных компонентов, гистохимии и растительного тела (организация и функция тканей, онтогенез, морфологические адаптации). Интерпретация изображений, полученных с помощью различных методов, может привести к корреляции формы и функции, расшифровке химического состава структуры, подтверждению в описании таксонов, пониманию инфекций фитопатогенами и другим подобным оценкам.

При исследовании микогетеротрофных (MH) растений (т.е. нефотосинтезирующих растений, получающих углерод из микоризных грибов ^4,5) замечательные аспекты их структурных адаптаций, закономерности колонизации тканей грибами и морфоанатомия подземных органов могут просветить их стратегии развития и отношения с гифами, которые являются источником питательных веществ. Подземные органы растений MH обычно демонстрируют важные адаптации, связанные с их связью с почвенными грибами, поэтому необходимо выполнить эти анатомические и морфологические исследования⁶. Не следует игнорировать воздушные органы видов MH, так как эндофиты также могут присутствовать в этих тканях, даже если они не являются микоризными грибами (личные наблюдения, пока не опубликованы).

Помимо устоявшейся сущности ассоциации микоризных грибов с видами MH в течение всего их жизненного цикла⁷, каждый вид орхидеи, даже автотрофный, имеет начальную облигатную микогетеротрофную стадию в естественной среде. Это происходит потому, что эмбрион орхидеи недифференцирован и не имеет эндосперма или семядолий, таким образом, будучи неспособным развиваться и утвердиться в естественной среде без питательной поддержки грибковых партнеров ^4,8. Учитывая, что протоколы симбиотического прорастания могут применяться не только к видам MH, но и к фотосинтезирующим орхидеям, с целью изучения специфичности орхидеи-гриба в прорастании и развитии протокормы, широко применяемая методология в инициативах по сохранению угрожаемых видов ^9,10,11.

В этой сборке методов мы описываем важные этапы, связанные со сбором, фиксацией и хранением образцов растений MH для анатомических исследований (раздел 1), анализа поверхности и отбора образцов (раздел 2), методов секционирования (от руки: раздел 3, микротомия: секция 4, криомикротомия: секция 5), окрашивание и монтаж (раздел 6), флуоресценция и конфокальная микроскопия грибковых эндофитов (раздел 7), сканирующая электронная микроскопия (секция 8), и просвечивающая электронная микроскопия (раздел 9). Кроме того, мы описываем симбиотический метод прорастания семян орхидей (MH и автотрофный, раздел 10), поскольку ранее упомянутые методы визуализации могут быть успешно применены для анализа грибковой колонизации семян, протокорм и саженцев в процессе прорастания.

Рисунок 1: Схематическое обобщение методов визуализации. Схемы содержат указания на этапы протокола, в которых они подробно описаны. Сокращения: GMA = метакрилат гликоля, OCT = соединение оптимальной температуры резания, SEM = сканирующая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Методам микроскопии, подробно описанным здесь (рисунок 1), предшествуют следующие основные этапы: сбор, фиксация, обезвоживание, встраивание и секционирование образцов. Поскольку этапы являются переменными (рисунок 1) в зависимости от выбранного метода (методов), важно думать заранее, учитывая фиксаторы, которые должны быть подготовлены и транспортированы на место сбора, как образцы должны быть подготовлены перед фиксацией, процессы обезвоживания, которые будут использоваться (раздел 1), а также различные возможности встраивания и методы секционирования (разделы 4, 5, и 9). На рисунке 1 последовательно обобщены все этапы, необходимые для каждого метода микроскопии, подробно описанного ниже.

Protocol

1. Сбор, фиксация и обслуживание образцов ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью MH растения обычно можно найти в темном лесном подлеске12,13, в основном во влажных и обильных мусором районах, тогда как частично растения MH можно найти в более открытых л…

Representative Results

После существенных этапов фиксации растительной ткани получаются клеточные структуры, максимально сходные с живым состоянием, учитывая морфологию, объем и пространственную организацию клеточных компонентов и тканей16. Наблюдать такие признаки в образцах после химическо…

Discussion

Анализ изображений в анатомии и морфологии растений имеет важный потенциал для достижения целей и помогает понять взаимосвязи между микогетеротрофными растениями и их незаменимыми грибковыми эндофитами, о чем свидетельствуют исследования подземных органов ^6,40<sup cl…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)