Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.
Yapısal botanik, bitkilerin ekolojisini, fizyolojisini, gelişimini ve evrimini tam olarak anlamak için vazgeçilmez bir bakış açısıdır. Mikoheterotrofik bitkileri (yani, mantarlardan karbon elde eden bitkileri) araştırırken, yapısal adaptasyonlarının dikkat çekici yönleri, mantarlar tarafından doku kolonizasyonu kalıpları ve yeraltı organlarının morfoanatomisi, gelişim stratejilerini ve besin kaynağı olan hiflerle ilişkilerini aydınlatabilir. Simbiyotik mantarların bir diğer önemli rolü orkide tohumlarının çimlenmesi ile ilgilidir; Tüm Orchidaceae türleri, çimlenme ve fide aşamasında (ilk mikoheterotrofi), hatta yetişkin aşamalarında fotosentez yapanlar bile mikoheterotrofiktir. Orkide tohumlarında besin rezervlerinin bulunmaması nedeniyle, mantar simbiyontları substratlar sağlamak ve çimlenmeyi sağlamak için gereklidir. Çimlenme aşamalarını yapısal perspektiflerle analiz etmek, mantarların tohumlarla etkileşimi ile ilgili önemli soruları da cevaplayabilir. Bu makalede önerildiği gibi, bitki dokularındaki mantar endofitlerini ortaya çıkarmak için farklı görüntüleme teknikleri uygulanabilir. Bitki organlarının serbest ve ince bölümleri boyanabilir ve daha sonra ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Buğday tohumu aglutininine konjuge edilmiş bir florokrom, mantarlara uygulanabilir ve konfokal mikroskopide bitki hücre duvarlarını vurgulamak için Calcofluor White ile birlikte inkübe edilebilir. Ek olarak, tarama ve iletim elektron mikroskobu metodolojileri mikoheterotrofik orkideler için detaylandırılmıştır ve bu protokollerin ilgili bitkilerde uygulanması olanakları araştırılmaktadır. Orkide tohumlarının simbiyotik çimlenmesi (yani, mikorizal mantarların varlığında), protokolde, çimlenmenin farklı aşamalarından elde edilen yapıların ışık, konfokal ve elektron mikroskobu ile analizler için hazırlanması olanakları ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Bitki morfolojisi ve anatomisini kapsayan botanik alanındaki yapısal araştırmalar, tüm organizmayı anlamada temeldir1,2 ve bitkilerin ekolojisi, fizyolojisi, gelişimi ve evrimi ile ilgili bilgileri bütünleştirmek ve katkıda bulunmak için vazgeçilmez perspektifler sağlar3. Bitki morfolojisi ve anatomisindeki yöntemler şu anda yakın zamanda ve bir asırdan fazla bir süre önce geliştirilen protokolleri, ekipmanları ve bilgileri içermektedir2. Klasik yöntemlerin (örneğin, ışık mikroskobu) ve daha yeni tekniklerin (örneğin, konfokal mikroskopi, X-ışını mikrotomografisi) sürekli olarak uygulanması ve uyarlanması aynı temel temele sahiptir: bir metodolojinin geliştirilmesini sağlayan teorik bilgi.
Bitki anatomisi ve morfolojisinde ana araç görüntüdür. Bu tür analizlerin basit gözlemler olduğu yanılgısına rağmen, öznel yorumlara yer vermek2, bu alandaki görüntüleri analiz etmek ve anlamak, uygulanan yöntemler (ekipman, analiz türü, metodolojik prosedürler), hücre bileşenleri, histokimya ve bitki gövdesi (doku organizasyonu ve fonksiyonu, ontojeni, morfolojik adaptasyonlar) hakkında bilgi gerektirir. Çeşitli yöntemlerle elde edilen görüntülerin yorumlanması, form ve fonksiyonun ilişkilendirilmesine, bir yapının kimyasal bileşiminin deşifre edilmesine, taksonların tanımlanmasında doğrulanmasına, fitopatojenlerin enfeksiyonlarının anlaşılmasına ve diğer bu tür değerlendirmelere yol açabilir.
Mikoheterotrofik (MH) bitkileri (yani, mikorizal mantarlardan karbon elde eden fotosentetik olmayan bitkiler4,5) araştırırken, yapısal adaptasyonlarının dikkat çekici yönleri, mantarlar tarafından doku kolonizasyonu kalıpları ve yeraltı organlarının morfoanatomisi, gelişim stratejilerini ve besin kaynağı olan hiflerle ilişkilerini aydınlatabilir. MH bitkilerinin yeraltı organları genellikle toprak mantarları ile olan ilişkileriyle ilgili önemli adaptasyonlar gösterir, bu nedenle bu anatomik ve morfolojik araştırmaların yapılması esastır6. MH türlerinin hava organları göz ardı edilmemelidir, çünkü endofitler mikorizal mantar olmasalar bile bu dokularda da bulunabilir (kişisel gözlemler, henüz yayınlanmamıştır).
Mikorizal mantarların MH türleri ile tüm yaşam döngüleriboyunca 7 olan ilişkisinin köklü özünün yanı sıra, her orkide türü, ototrofik olanlar bile, doğal ortamlarda başlangıçta zorunlu bir mikoheterotrofik aşamaya sahiptir. Orkidelerin embriyosunun farklılaşmamış olması ve endosperm veya kotiledonlardan yoksun olması, dolayısıyla mantar ortaklarının beslenme desteği olmadan doğal ortamlarda kendini geliştirememesi ve kuramamasıdır 4,8. Simbiyotik çimlenme protokollerinin sadece MH türlerine değil, aynı zamanda fotosentez yapan orkidelere de uygulanabileceği göz önüne alındığında, çimlenme ve protocorm gelişiminde orkide-mantar özgüllüğünü araştırmayı amaçlayan, tehdit altındaki türlerin korunmasına yönelik girişimlerde çok uygulanan bir metodoloji 9,10,11.
Bu yöntem derlemesinde, anatomik çalışmalar için MH bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve depolanması (bölüm 1), yüzey analizi ve numune seçimi (bölüm 2), bölümleme yöntemleri (serbest: bölüm 3, mikrotomi: bölüm 4, kriyomikrotomi: bölüm 5), boyama ve montaj (bölüm 6), mantar endofitlerinin floresan ve konfokal mikroskopisi (bölüm 7), taramalı elektron mikroskobu (bölüm 8), ve transmisyon elektron mikroskobu (bölüm 9). Ek olarak, orkide tohumları için simbiyotik çimlenme yöntemini (MH ve ototrofik, bölüm 10) tanımlamaktayız, çünkü daha önce bahsedilen görüntüleme yöntemleri, çimlenme sürecinde tohumların, protokormların ve fidelerin mantar kolonizasyonunu analiz etmek için başarıyla uygulanabilir.
Şekil 1: Görüntüleme yöntemlerinin şematik özeti. Şemalar, ayrıntılı olarak açıklandığı protokol adımlarının göstergelerini sağlar. Kısaltmalar: GMA = glikol metakrilat, OCT = optimal kesme sıcaklığı bileşiği, SEM = taramalı elektron mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan mikroskopi teknikleri (Şekil 1) aşağıdaki temel adımlardan önce gelir: numunelerin toplanması, sabitlenmesi, dehidrasyonu, gömülmesi ve bölümlenmesi. Seçilen teknik(ler)e bağlı olarak adımlar değişken olduğundan (Şekil 1), hazırlanacak ve toplama alanına taşınacak fiksatörleri, numunelerin sabitlemeden önce nasıl hazırlanması gerektiğini, kullanılacak dehidrasyon işlemlerini (bölüm 1) ve farklı gömme olanakları ve kesitleme yöntemlerini (bölüm 4, 5, ve 9). Şekil 1 , aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan her mikroskopi tekniği için gerekli tüm adımları sırayla özetlemektedir.
Bitki anatomisi ve morfolojisindeki görüntü analizleri, yeraltı organları6,40, tohumların simbiyotik çimlenmesinin yapısal analizleri39 ve hava ve üreme yapıları 41 ile gösterildiği gibi, amaçları yerine getirmek ve mikoheterotrofik bitkiler ile vazgeçilmez mantar endofitleri arasındaki ilişkileri anlamaya yardımcı olmak için önemli bir potansiyele sahiptir. . Yapısal botanik, son on yılda bi…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar FAEPEX ve FAPESP’in (2015/26479-6) finansmanına teşekkür ediyor. MPP, yüksek lisans bursu için Capes’e teşekkür eder (süreç 88887.600591/2021-00) ve CNPq. JLSM, verimlilik hibeleri için CNPq’ya teşekkür eder (303664/2020-7). Yazarlar ayrıca LME (Elektron Mikroskobu Laboratuvarı – IB / Unicamp), INFABiC (Hücre Biyolojisine Uygulanan Fotonik Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü – Unicamp) ve LaBiVasc (Vasküler Biyoloji Laboratuvarı – DBEF / IB / Unicamp) tarafından sağlanan ekipman ve yardıma erişime teşekkür eder; LAMEB (UFSC) ve Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) kriyoproteksiyon protokolüne katkılarından dolayı; TEM protokolüne katkılarından dolayı LME.
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | (for SEM stubs mounting) |
Agar-agar (AA) | Sigma-Aldrich | A1296 | (for seeds germination tests) |
Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909 | fluorescent dye (detects cellulose) |
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 | Sigma-Aldrich | C2488 | (for toluidine blue O staining) |
Conductive Double-Sided Carbon Tape | Fisher Scientific | 50-285-81 | (for SEM) |
Confocal Microscope | Zeiss | (any model) | |
Copper Grids | Sigma-Aldrich | G4776 | (for TEM) |
Critical-point dryer | Balzers | (any model) | |
Cryostat | Leica Biosystems | (any model) | |
Dissecting microscope | Leica Biosystems | (= stereomicroscope, any model) | |
Entellan | Sigma-Aldrich | 107960 | rapid mounting medium for microscopy |
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) | Sigma-Aldrich | 459836 | (= ethanol, for dehydration processes) |
Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | (for NBF solution preparation) |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | histological tissue fixative |
Gelatin capsules for TEM | Fisher Scientific | 50-248-71 | (for resin polymerisation in TEM) |
Gelatin solution, 2% in H2O | Sigma-Aldrich | G1393 | (dilute for slides preparation – OCT adherence) |
Glutaraldehyde solution, 25% | Sigma-Aldrich | G6257 | (for Karnovsky’s solution preparation) |
HistoResin | Leica Biosystems | 14702231731 | glycol methacrylate (GMA) embedding kit |
Iodine | Sigma-Aldrich | 207772 | (for Lugol solution preparation) |
Lead(II) nitrate | Sigma-Aldrich | 228621 | Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining) |
Light Microscope | Olympus | (any model) | |
LR White acrylic resin | Sigma-Aldrich | L9774 | hydrophilic acrylic resin for TEM |
Lugol solution | Sigma-Aldrich | 62650 | (for staining) |
Metal stubs for specimen mounts | Rave Scientific | (for SEM, different models) | |
Microtome | Leica Biosystems | manual rotary microtome or other model | |
Oatmeal agar (OMA) | Millipore | O3506 | (for seeds germination tests) |
OCT Compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek USA | 4583 | embedding medium for frozen tissues |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich | 201030 | OsO4 (for TEM postfixation) |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | sealing thermoplastic film |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | (for Karnovsky’s solution preparation) |
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O | Sigma-Aldrich | P8920 | (for slides preparation – OCT adherence) |
Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425 | poly-L-lysine coated glass slides |
Polyethylene Molding Cup Trays | Polysciences | 17177A-3 | (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin) |
Polyethylene Molding Cup Trays | Polysciences | 17177C-3 | (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin) |
Potassium iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | (for Lugol solution preparation) |
Potato Dextrose Agar (PDA) | Millipore | 70139 | (for seeds germination tests) |
Scanning Electron Microscope | Jeol | (any model) | |
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] | Sigma-Aldrich | A3648 | (for slides preparation – OCT adherence) |
Silane-Prep Slides | Sigma-Aldrich | S4651 | glass slides coated with silane |
Silica gel orange, granular | Supelco | 10087 | (for dessicating processes) |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer) |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining) |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | NaClO (for seeds surface disinfection) |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | 71640 | Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation) |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | NaH2PO4·H2O (for NBF and PB) |
Sputter coater | Balzers | (any model) | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | C12H22O11 (for cryoprotection and germination test) |
Sudan III | Sigma-Aldrich | S4131 | (for staining) |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | 198102 | (for staining) |
Sudan Black B | Sigma-Aldrich | 199664 | (for staining) |
Syringe | (3 mL, any brand, for TEM contrast staining) | ||
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm | Millipore | SLGV033R | PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining) |
Tek Bond Super Glue 793 | Tek Bond Saint-Gobain | 78072720018 | liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | (for staining) |
Transmission Electron Microscope | Jeol | (any model) | |
Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | T8877 | (for the tetrazolium test in seeds germination) |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining) |
Ultramicrotome | Leica Biosystems | (any model) | |
Uranyl acetate | Fisher Scientific | 18-607-645 | UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining) |
Vacuum pump | (any model) | ||
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | TermoFisher Scientific | W11261 | fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues) |