Computationele modellering van retinale neuronen voor visueel protheseonderzoek - Fundamentele benaderingen

Summary

We vatten een workflow samen om het gedrag van een netvliesneuron computationeel te modelleren als reactie op elektrische stimulatie. Het computationele model is veelzijdig en omvat automatiseringsstappen die nuttig zijn bij het simuleren van een reeks fysiologische scenario's en het anticiperen op de uitkomsten van toekomstige in vivo / in vitro studies.

Abstract

Computationele modellering is een steeds belangrijkere methode geworden in neurale engineering vanwege het vermogen om gedrag van in vivo en in vitro systemen te voorspellen. Dit heeft als belangrijkste voordeel dat het aantal dieren dat nodig is in een bepaald onderzoek wordt geminimaliseerd door een vaak zeer nauwkeurige voorspelling van fysiologische uitkomsten te bieden. Op het gebied van visuele prothesen heeft computationele modellering een scala aan praktische toepassingen, waaronder het informeren van het ontwerp van een implanteerbare elektrode-array en het voorspellen van visuele waarnemingen die kunnen worden opgewekt door de levering van elektrische impulsen uit de genoemde array. Sommige modellen die in de literatuur worden beschreven, combineren een driedimensionale (3D) morfologie om het elektrische veld te berekenen en een kabelmodel van het neuron of neurale netwerk van belang. Om de toegankelijkheid van deze tweestapsmethode te vergroten voor onderzoekers die mogelijk beperkte eerdere ervaring hebben met computationele modellering, bieden we een video van de fundamentele benaderingen die moeten worden gevolgd om een computationeel model te construeren en te gebruiken bij het voorspellen van de fysiologische en psychofysische uitkomsten van stimulatieprotocollen die worden ingezet via een visuele prothese. De gids omvat de stappen om een 3D-model te bouwen in een eindige elementenmodellering (FEM), de constructie van een retinaal ganglioncelmodel in een multi-compartimentale neuron computationele software, gevolgd door de samensmelting van de twee. Een eindige elementen modelleringssoftware om numeriek fysieke vergelijkingen op te lossen, zou worden gebruikt om elektrische veldverdeling in de elektrische stimulaties van weefsel op te lossen. Vervolgens werd gespecialiseerde software gebruikt om de elektrische activiteiten van een neurale cel of netwerk te simuleren. Om deze tutorial te volgen, zou bekendheid met het werkingsprincipe van een neuroprothese, evenals neurofysiologische concepten (bijv. Actiepotentiaalmechanisme en een goed begrip van het Hodgkin-Huxley-model) vereist zijn.

Introduction

Visuele neuroprothesen zijn een groep apparaten die stimulaties (elektrisch, licht, enz.) leveren aan de neurale cellen in het visuele pad om fosfenen of het gevoel van het zien van het licht te creëren. Het is een behandelingsstrategie die al bijna een decennium klinisch wordt gebruikt voor mensen met permanente blindheid veroorzaakt door degeneratieve retinale ziekten. Typisch, een compleet systeem zou een externe camera bevatten die de visuele informatie rond de gebruiker vastlegt, een voeding en computereenheid om het beeld te verwerken en te vertalen naar een reeks elektrische pulsen, en een geïmplanteerde elektrode-array die het neurale weefsel verbindt en de elektrische pulsen aan de neurale cellen levert. Het werkingsprincipe maakt het mogelijk om een visuele neuroprothese op verschillende plaatsen langs het visuele pad van het netvlies naar de visuele cortex te plaatsen, zolang deze stroomafwaarts van het beschadigde weefsel is. Een meerderheid van het huidige onderzoek in visuele neuroprothesen richt zich op het verhogen van de effectiviteit van de stimulatie en het verbeteren van de ruimtelijke scherpte om een natuurlijker zicht te bieden.

In de inspanningen om de effectiviteit van de stimulatie te verbeteren, is computationele modellering een kosten- en tijdbesparende methode geweest om een protheseontwerp te valideren en de visuele uitkomst ervan te simuleren. Computationele modellering op dit gebied won aan populariteit sinds 1999 toen Greenberg¹ de reactie van een retinale ganglioncel op extracellulaire elektrische stimuli modelleerde. Sindsdien is computationele modellering gebruikt om de parameters van de elektrische puls ^2,3 of het geometrische ontwerp van de elektrode ^4,5 te optimaliseren. Ondanks de variatie in complexiteit en onderzoeksvragen, werken deze modellen door het bepalen van de elektrische spanningsverdeling in het medium (bijvoorbeeld neuraal weefsel) en het schatten van de elektrische respons die de neuronen in de buurt zullen produceren als gevolg van de elektrische spanning.

De elektrische spanningsverdeling in een geleider kan worden gevonden door de Poissonvergelijkingen⁶ op alle locaties op te lossen:

waarbij E het elektrische veld is, V de elektrische potentiaal, J de stroomdichtheid en σ de elektrische geleidbaarheid is. De in de vergelijking geeft een verloopoperator aan. In het geval van stationaire stroom worden de volgende randvoorwaarden aan het model opgelegd:

waarbij n de normaalwaarde is voor het oppervlak, Ω de grens vertegenwoordigt en I₀ de specifieke stroom. Samen creëren ze elektrische isolatie aan de buitengrenzen en creëren ze een stroombron voor een geselecteerde grens. Als we uitgaan van een monopolaire puntbron in een homogeen medium met een isotrope geleidbaarheid, kan de extracellulaire elektrische potentiaal op een willekeurige locatie worden berekend met⁷:

waarbij I_e de stroom is en de afstand tussen de elektrode en het meetpunt. Wanneer het medium inhomogeen of anisotroop is, of de elektrodearray meerdere elektroden heeft, kan een computationele suite om de vergelijkingen numeriek op te lossen handig zijn. Een eindige elementen modelleringssoftware⁶ verdeelt de volumegeleider in kleine secties die bekend staan als 'elementen'. De elementen zijn met elkaar verbonden, zodat de effecten van verandering in het ene element verandering in andere beïnvloeden, en het lost de fysieke vergelijkingen op die dienen om deze elementen te beschrijven. Met de toenemende rekensnelheid van moderne computers kan dit proces binnen enkele seconden worden voltooid. Zodra de elektrische potentiaal is berekend, kan men vervolgens de elektrische respons van het neuron schatten.

Een neuron verzendt en ontvangt informatie in de vorm van elektrische signalen. Dergelijke signalen zijn er in twee vormen - graduele potentialen en actiepotentialen. Graduele potentialen zijn tijdelijke veranderingen in de membraanpotentiaal waarbij de spanning over het membraan positiever (depolarisatie) of negatiever (hyperpolarisatie) wordt. Graduele potentialen hebben meestal gelokaliseerde effecten. In cellen die ze produceren, zijn actiepotentialen alles-of-niets-reacties die lange afstanden kunnen afleggen over de lengte van een axon. Zowel graduele als actiepotentialen zijn gevoelig voor zowel de elektrische als de chemische omgeving. Een actiepotentiaalpiek kan worden geproduceerd door verschillende neuronale celtypen, waaronder de retinale ganglioncellen, wanneer een drempeltransmembraanpotentiaal wordt overschreden. Het actiepotentiaal spiking en propagatie activeren vervolgens synaptische overdracht van signalen naar downstream neuronen. Een neuron kan worden gemodelleerd als een kabel die is verdeeld in cilindrische segmenten, waarbij elk segment capaciteit en weerstand heeft als gevolg van het lipide bilayer membraan⁸. Een neuron computationeel programma⁹ kan de elektrische activiteit van een elektrisch-exciteerbare cel schatten door de cel in meerdere compartimenten te discreteren en het wiskundige model¹⁰ op te lossen:

In deze vergelijking is C_mde membraancapaciteit, V_e,n is de extracellulaire potentiaal op knooppunt n, V_i,n de intracellulaire potentiaal op knooppunt n, R_nde intracellulaire (longitudinale) weerstand op knooppunt n, en _I-ion is de ionische stroom die door de ionkanalen op knooppunt n gaat. De waarden van V uit het FEM-model worden geïmplementeerd als V_e,n voor alle knooppunten in het neuron wanneer de stimulatie actief is.

De transmembraanstromen van ionkanalen kunnen worden gemodelleerd met behulp van Hodgkin-Huxley-formuleringen¹¹:

waarbij g_i de specifieke geleiding van het kanaal is, V_m de transmembraanpotentiaal (V_i,n - V_e,n) en E_ion de omkeerpotentiaal van het ionenkanaal. Voor spanningsafhankelijke kanalen, zoals Na-kanaal, worden dimensieloze parameters, m en h, die de kans op het openen of sluiten van de kanalen beschrijven, geïntroduceerd:

waarbij de maximale membraangeleiding voor het specifieke ionkanaal is en de waarden van de parameters m en h worden bepaald door differentiaalvergelijkingen:

waarbij α_x en β_x spanningsafhankelijke functies zijn die de snelheidsconstanten van het ionkanaal definiëren. Ze hebben over het algemeen de vorm:

De waarden van de parameters in deze vergelijkingen, inclusief maximale geleiding, evenals de constanten A, B, C en D, werden meestal gevonden uit empirische metingen.

Met deze bouwstenen kunnen modellen van verschillende complexiteiten worden gebouwd door de beschreven stappen te volgen. Een FEM-software is nuttig wanneer de Poisson-vergelijking analytisch niet kan worden opgelost, zoals in het geval van inhomogene of anisotrope geleiding in de volumegeleider of wanneer de geometrie van de elektrodearray complex is. Nadat de extracellulaire potentiaalwaarden zijn opgelost, kan het neuronkabelmodel numeriek worden opgelost in de neuron computationele software. Het combineren van de twee software maakt de berekening van een complexe neuroncel of netwerk naar een niet-uniform elektrisch veld mogelijk.

Een eenvoudig tweestapsmodel van een retinale ganglioncel onder een suprachoroïdale stimulatie zal worden gebouwd met behulp van de bovengenoemde programma's. In deze studie zal de retinale ganglioncel worden onderworpen aan een reeks magnituden van elektrische stroompulsen. De locatie van de cel ten opzichte van de stimulus wordt ook gevarieerd om de afstand-drempelrelatie weer te geven. Bovendien omvat de studie een validatie van het computationele resultaat tegen een in vivo studie van de corticale activeringsdrempel met behulp van verschillende groottes van stimulatie-elektrode¹², evenals een in vitro studie die de relatie tussen de elektrode-neuronafstand en de activeringsdrempel¹³ aantoont.

Protocol

1. Het opstellen van het eindige elementenmodel voor elektrische potentiaalberekeningen

1. Bepaal de simulatiestappen en de complexiteit van het model
   OPMERKING: Het doel van de eerste stap is om het doel van de modellering te verduidelijken, die de noodzakelijke elementen van het model en de simulatieprocedure zal bepalen. Een belangrijk punt om te overwegen is het gedrag van neurale cellen dat door het model moet worden aangetoond en welk testprotocol nodig zou zijn om dat gedrag aan te tonen. Deze studie toont een afstand-drempelrelatie voor een neuron dat extracellulair wordt gestimuleerd, evenals de elektrodegrootte-drempelcurve. Om dit te doen, is een neuraal celmodel nodig dat is gecompartimenteerd in verschillende secties (om de variatie van morfologische en biofysische parameters in het neuron op te nemen) dat gevoelig is voor extracellulaire spanning en simulatie van een reeks elektrodegroottes en -posities.
   1. Definieer de onderzoeksvraag en de experimentele variabelen.
      1. Definieer een onderzoeksvraag en testprotocol om de constructie van het model te begeleiden. Het is het beste om te beginnen met een duidelijke vraag en een model te bouwen dat zo eenvoudig mogelijk is om het te beantwoorden.
   2. Bepaal de benodigde elementen die in het volledige model moeten worden opgenomen
      OPMERKING: In deze modelleringsbenadering wordt de cel gezien als ondergedompeld in een elektrisch geleidend medium, dat wil zeggen het biologische weefsel. De elektrische stimulatie vindt plaats over deze 'volumegeleider', d.w.z. het medium, wat resulteert in een verdeling van de elektrische potentiaal.
      1. Bepaal op basis van de onderzoeksvragen en variabelen die moeten worden opgelost of beide elementen (FEM- en neuronkabelmodel) nodig zijn. Als de modellering bijvoorbeeld een enkele elektrode nodig heeft die kan worden vereenvoudigd als een puntbron en dat het medium homogeen is, is een FEM misschien niet nodig en kan een analytische berekening van het extracellulaire elektrische veld worden uitgevoerd om het te vervangen.
2. Download en installeer de software
   OPMERKING: De studie gebruikte de versies van softwaretoepassingen (COMSOL, NEURON en Python Anaconda) en hardware die zijn gespecificeerd in de materiaaltabel. Er kunnen kleine verschillen in stappen of resultaten zijn als verschillende versies van de software/hardware worden gebruikt.
   1. Download de software die past bij het besturingssysteem van de computer en koop indien nodig een licentie. Zorg ervoor dat alle vereiste simulatiemodules zijn gedownload en installeer alle software.
3. Verzamel de gegevens over de anatomie van het te modelleren weefsel en de cel
   OPMERKING: Voor deze methode werden de anatomische en biofysische parameters ontleend aan empirische bevindingen. Het is gebruikelijk dat computationele modellen parameters mengen die in verschillende soorten zijn gemeten vanwege de onbeschikbaarheid van gegevens. Voor een simulatie van suprachoroïdale stimulatie moeten de weefsellagen tussen de stimulerende en de referentie-elektroden in het model worden opgenomen.
   1. Verzamel de anatomie van het weefsel uit histologische studies.
      1. In dit model, neem het vaatvlies, het netvliesweefsel en de glasvochtdomeinen op, waarbij elk domein wordt gemodelleerd als een rechthoekig prisma voor een eenvoudige constructie van het model. Verzamel de gemiddelde dikte van het netvliesweefsel uit gepubliceerde histologische gegevens¹⁴ om later te worden gebruikt als de hoogte van elk prisma.
   2. Verzamel de morfologiegegevens van één cel uit celkleuring of openbare neurondatabase.
      1. Download de gedetailleerde neuronmorfologie uit een database zoals NeuroMorpho.org, die een zoekmetagegevensfunctie biedt om het relevante neuron te vinden op basis van soort, hersengebied, celtype, enz. Zoek voor deze studie Guo's OFF RGC-model (D23WM13_27_1-OffRGC_msa)¹⁵ door Rabbit > New Zealand White in het Species-veld en Retina in het Brain Region-veld in te voeren. Klik op het model en download het .swc-bestand.
4. Verzamel de biofysische gegevens van de gemodelleerde cel
   OPMERKING: De biofysische parameters omvatten de elektrische geleidbaarheidswaarden voor elke weefsellaag en de elektrische parameters van de neurale membraan- en ionkanalen.
   1. Vanwege de beschikbaarheid van gegevens, gebruik de elektrische geleidbaarheidswaarden die werden genomen van het konijn¹⁶ voor het weefselmodel, terwijl de dynamiek van de ionkanalen was gebaseerd op het Sheasby en Fohlmeister-model van het tijgersalamander-netvlies¹⁷.
5. Bouw de geometrie van het eindige elementenmodel van het weefsel en de elektrode in de FEM-software
   OPMERKING: De geometrie van het weefsel en de elektrode-array beïnvloeden beide de elektrische potentiaalverdeling, die op zijn beurt het gedrag van de neurale cel beïnvloedt. Daarom is het bouwen van een realistische geometrie van het medium waar de cellen zich bevinden, evenals de elektrode, belangrijk. De FEM-software die in deze zelfstudie wordt gebruikt, heeft een GUI die een eenvoudige constructie van modelgeometrie mogelijk maakt.
   1. Het FEM-model instellen in de GUI van de software:
      1. Voer de FEM-software uit en klik op Model Wizard > 3D. Vouw in de keuzelijst Natuurkunde selecteren de AC/DC-> Elektrische velden en Stroom > Elektrische stromen (ec) uit en klik vervolgens op Toevoegen. Klik op Studie en voeg een stationaire studie toe onder de optie Algemene studies en klik vervolgens op Gereed (aanvullende figuur 1).
   2. Het instellen van de eenheid en geometrische parameters van de elektrode.
      1. Klik in de modelbouwerstructuur op Parameters 1. Typ in de tabel 'elec_rad' in het veld Naam en '50' in het veld Expressie om een elektrode te maken met een straal van 50 eenheden. Klik vervolgens op Geometrie en verander de lengte-eenheid in μm, omdat de soma van een typische retinale ganglioncel ongeveer 10 μm in diameter is (aanvullende figuur 2).
   3. De weefsellagen maken met blokdomeinen
      OPMERKING: Om de modelgeometrie te bouwen, werden drie blokken gebruikt om verschillende structuren in het oog weer te geven. Blok 1 vertegenwoordigde het vaatvlies, blok 2 het netvliesweefsel en blok 3 het glasvocht.
      1. Klik met de rechtermuisknop op Geometry 1 > Block om een blokdomein te maken. Herhaal deze stap nog twee keer om in totaal drie blokken te maken. Stel voor alle blokken zowel de diepte als de breedte in op 5.000 μm en wijzig de optie Basis (onder Positie) in Centreren. Wijs de volgende waarden voor hoogte (onder Grootte en vorm) en z (onder Positie) toe voor elk blok:
         Blok 1: Hoogte = 112 μm, z = 0 μm
         Blok 2: Hoogte = 151 μm, z = 131,5 μm
         Blok 3: Hoogte = 5.000 μm, z = 2.707 μm
   4. Een werkvlak maken om een elektrode aan het model toe te voegen
      1. Klik met de rechtermuisknop op geometrie 1 in de modelstructuur en kies Werkvlak. Klik op Werkvlak 1 en wijzig het vlaktype in Vlak parallel, klik op de knop Selectie activeren onder het vlaktype en kies het onderste oppervlak van blok 1 (blk 1 > 1).
   5. Een schijfelektrode op het werkvlak tekenen
      1. Klik op Vlakgeometrie onder Werkvlak 1 en klik op Schets in de hoofdwerkbalk. Selecteer Cirkel, klik ergens in de rechthoek op het tabblad Afbeeldingen en sleep om een schijfelektrode te maken. Wijzig de straal in 'elec_rad' μm, xw en yw in 0 μm en klik vervolgens op Alles bouwen.
   6. Materiaaleigenschappen toewijzen aan elk domein
      OPMERKING: Door de stappen te volgen om de geometrie te bouwen, zou het model worden gescheiden in verschillende 'domeinen', die individuele 3D-onderdelen zijn die de volledige geometrie vormen. Aan elk domein moet een elektrische geleidbaarheidswaarde worden toegewezen om de elektrische veldverdeling over het hele model te berekenen.
      1. Klik in de modelstructuur met de rechtermuisknop op Materiaal > Leeg materiaal en klik vervolgens op Materiaal 1 en wijzig de selectie in Handmatig.
      2. Klik op de domeinen in het venster Afbeeldingen zodat alleen domein 1 wordt gekozen. Kies Materiaaleigenschappen > Basiseigenschappen > Elektrische geleidbaarheid, klik op de knop Toevoegen aan materiaal en wijzig de elektrische geleidbaarheidswaarde in de waarde in 0,043 S/m¹⁵.
      3. Herhaal de stappen voor domeinen 2 en 3, met de elektrische geleidbaarheidswaarden van respectievelijk 0,7¹⁶ en 1,55¹⁶ S/m (aanvullende figuur 3).
   7. Een 3D-model meshen: Als u het model wilt meshen, gaat u naar de modelstructuur en klikt u met de rechtermuisknop op Mesh 1 > Free Tetrahedral. Klik op Free Tetrahedral 1 en kies Build All.
      OPMERKING: Het meshingproces verdeelt de hele geometrie in kleinere 'elementen' (een element is een virtueel segment van de geometrie van het model waar de fysische vergelijkingen numeriek worden opgelost). Meshing met kleinere elementen verhoogt theoretisch de nauwkeurigheid van de benadering, maar is computationeel uitputtend. Een gangbare praktijk is door het model te starten met schaarse mesh en het resultaat van de simulatie vast te leggen, vervolgens de simulatie elke keer continu te herhalen met kleinere mesh-elementen en de resultaten te vergelijken. Het verfijningsproces kan stoppen wanneer er geen significant verschil is in de berekeningsresultaten van volgende verfijningsstappen.
      1. De mesh-kwaliteit beoordelen: Klik met de rechtermuisknop op Mesh 1 en kies Statistieken om het histogram van de elementkwaliteit weer te geven. Volg de onderstaande stappen voor het verfijnen van de mazen om de kwaliteit van de elementen te verbeteren.
         OPMERKING: Het gebruik van de standaard meshing kan veel elementen van lage kwaliteit produceren, wat op zijn beurt onnauwkeurige berekeningen oplevert. In de meeste gevallen is een zekere mate van mesh-verfijning nodig.
      2. Het gaas rond de omtrek van de elektrode verfijnen
         OPMERKING: De gebieden waar abrupte veranderingen in het elektrische veld kunnen optreden, vereisen meestal een verfijnder gaas. Hier werd een dichtere meshing rond de omtrek van de elektrode toegevoegd met behulp van de randverdelingsfunctie.
         1. Verwijder eerst het bestaande Vrije Tetraëder 1-gaas. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op Mesh 1 > Distribution, klik op Distribution 1, verander het Geometric Entity Level in Edge en kies Edges 19-22 (de omtrek van de schijfelektrode).
         2. Stel het distributietype in op Vast aantal elementen en wijzig het veld Aantal elementen in elec_rad*3/10 om de elementen redelijk klein te maken.
      3. Het net over het vaatvlies en het netvliesweefsel verfijnen
         1. Klik in de modelstructuur met de rechtermuisknop op Mesh 1 > Swept. Klik op Swept 1. Kies Domeinen 1 en 2. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op Mesh 1 > Free Tetrahedral, stel het geometrische entiteitsniveau in op Resterend en klik op Alles bouwen. (Optioneel: Controleer het histogram van de elementkwaliteit nogmaals om er zeker van te zijn dat de elementen van lage kwaliteit in verhouding zijn verminderd).
6. Pas de fysica toe op het eindige elementenmodel
   OPMERKING: De 'fysica' in de FEM-software zijn sets wiskundige vergelijkingen en randvoorwaarden die aan het model moeten worden toegewezen. Het is de berekening van de oplossing voor de gelijktijdige reeks vergelijkingen die wordt uitgevoerd tijdens het uitvoeren van het model. De keuze van de fysica om toe te passen op geometrie hangt af van het fysische fenomeen dat wordt gesimuleerd. De elektrische stroomfysica, zoals gebruikt in dit model, observeert bijvoorbeeld de elektrische veldverdeling en verwaarloost het magnetische (inductieve) fenomeen. Andere fysica zou op de meetkunde kunnen worden toegepast als andere fysische problemen (bijv. temperatuurverdeling, mechanische spanning, enz.) moeten worden opgelost.
   1. Selectie van fysica en toepassing van randvoorwaarden
      OPMERKING: Als een constante spanningspuls moet worden toegepast, moet de grenstoestand met zwevende potentiaal worden vervangen door een elektrische potentiaalgrensvoorwaarde.
      1. Vouw Elektrische stromen 1 uit in modelstructuur en controleer of Stroombehoud 1, Elektrische isolatie 1 en Beginwaarden 1 worden vermeld. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de elektrische stromen 1 > grond (dit wijst 0 V toe aan een ver vlak, waarbij een verre referentie-elektrode wordt gesimuleerd) en pas dit toe op het oppervlak dat het verst van de elektrode verwijderd is (oppervlak 10).
      2. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de elektrische stromen 1 > zwevende potentiaal (dit simuleert een stroombron met constante stroom), toegewezen aan de schijfelektrode (oppervlak 14) en wijzig de I _0-waarde in 1 [μA] om een unitaire stroom toe te passen.
   2. Het uitvoeren van de simulatie met een parametrische sweep.
      OPMERKING: Deze stap voert de simulatie uit en er is een parametrische sweeping toegevoegd, waarbij meerdere simulaties zijn uitgevoerd met de waarde van een parameter die in elke simulatie is gewijzigd. Hier werd de elektroderadiusparameter geveegd en werd de elektrische potentiaalverdeling voor elke simulatie opgeslagen in het modelbestand. Nadat de simulatie was uitgevoerd, werd de tak Resultaten in de modelstructuur gevuld met een multislice-grafiek met elektrische potentiaal (ec).
      1. Klik in de modelstructuur met de rechtermuisknop op Studie 1 > Parametrische sweep. Klik op Parametric Sweep en klik in de tabel Studie-instelling op Toevoegen en kies vervolgens elec_rad voor de parameternaam.
      2. Typ '50, 150, 350, 500' voor de parameterwaardelijst en 'μm' voor de parametereenheid en klik op Berekenen om het onderzoek uit te voeren (aanvullende figuur 4).

Figuur 1: Het creëren van de tisssue geometrie. Een blokgeometrie werd in het FEM-model ingevoegd om het weefsel weer te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De geometrie van de elektrode maken. (A) Een werkvlak maken om de schijfelektrode te tekenen. (B) Schetsen van een cirkel op een werkvlak om een schijfelektrode te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Het histogram van de elementkwaliteit van het FEM-model. Het histogram toonde de kwaliteit van de elementen in het hele model. Mesh-verfijningen zijn nodig als een aanzienlijk deel van de elementen zich in het gebied van lage kwaliteit bevindt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Een stroomwaarde toekennen aan de elektrode. Een unitaire stroom toegepast op de geometrie van de elektrode in de FEM-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. De geometrie van de neurale cel importeren in de GUI van de neuron computational suite

1. De geometrie van het celmodel opbouwen
   1. De morfologie importeren met de functie Celbouwer.
      1. Voer 'nrngui' uit vanuit de installatiemap van de Neuron Computational Suite, klik op Tools > Miscellaneous > Import 3D en vink vervolgens het vakje Kies een bestand aan.
      2. Zoek het gedownloade .swc-bestand en klik op Lezen. Zodra de geometrie is geïmporteerd, klikt u op Exporteren > Cell Builder (aanvullende afbeelding 5).
   2. Een .hoc-bestand van de geïmporteerde celmorfologie maken
      1. Ga naar het tabblad Subsets en observeer de subsets die vooraf zijn gedefinieerd in het model (bijvoorbeeld soma, axon, basaal, enz.). Vink het vakje Continu maken aan, ga naar Beheer > exporteren en exporteer de morfologie als 'rgc.hoc'.
   3. De morfologie van de cel bekijken
      1. Klik op Tool > Model View > 1 Real Cells > Root Soma[0] op de werkbalk, klik met de rechtermuisknop op het verschijnende venster en klik op Axis Type > View Axis. Bij visuele inspectie is de dendritische velddiameter van dit model ongeveer 250 μm. Sluit de NEURON-vensters voorlopig.

Figuur 5: De informatie van het neuronmodel exporteren als een .hoc-bestand. De geometrie van het neuron werd geëxporteerd naar een .hoc-bestand om verdere wijzigingen mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Het meten van de afmeting van het neuron. De morfologie van het neuron (bovenaanzicht) werd weergegeven in de GUI van de neuron computationele suite met de x-y-assen over elkaar. De schaal was in μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Programmeren van de NEURON-berekeningssimulatie

1. De morfologie van de cel aanpassen door te programmeren in .hoc taal
   OPMERKING: De morfologie van de cel kan worden aangepast via de functie Cell Builder van de GUI. Hoe dit kan worden gedaan door het .hoc-bestand te bewerken om het proces te versnellen, wordt echter gedemonstreerd. Het .hoc-bestand definieert de topologie (fysieke verbindingen tussen elk deel van de neuronen), morfologie (de lengte, diameter en locatie van elke neuronsectie) en de biofysische eigenschappen (ionkanaalparameters) van de gemodelleerde cel. De volledige documentatie voor .hoc programmeren is te vinden in: https://neuron.yale.edu/neuron/static/new_doc/index.html#,
   1. Open het resulterende .hoc-bestand met een teksteditor (bijvoorbeeld Kladblok). Voeg een axon initieel segment van 40 μm lengte en een smal axonaal segment van 90 μm lengte dicht bij de soma zoals beschreven in Sheasby en Fohlmeister¹⁷, en verander de lengte van de dendrieten zodat de dendritische veldgrootte 180 μm wordt om overeen te komen met de G1-cel in Rockhill, et ^al.18.
      1. Nieuwe celsecties maken en de topologische verbindingen voor elke sectie definiëren.
         1. Als u nieuwe celsecties wilt maken voor het axoninitiële segment (AIS) en het smalle axonale segment (NS), voegt u deze regels toe aan het begin van het bestand rgc.hoc:
            AIS, NS // Celcompartimenten declareren die AIS en NS worden genoemd
            Vervang vervolgens de regel 'connect axon(0), soma[1](1)' door:
            verbind ais(0), soma[1](1) // Het eerste segment van AIS verbinden met het einde van soma[1]
            ns(0), ais(1) verbinden // Het eerste segment van NS verbinden met het einde van AIS
            axon(0), ns(1) verbinden // Het eerste segment van het axon verbinden met het einde van NS
      2. De 3D-posities, diameters en lengte van de celsecties definiëren
         1. Definieer de 3D-posities en -diameters van de AIS- en NS-compartimenten door deze regels binnen de haakjes 'proc shape3d_31()' te schrijven:
            ais { pt3dadd(-2.25, -1.55, 0, 1) // De eerste drie getallen zijn de xyz-coördinaat en de diameter is 1 μm
            pt3dadd(37,75, -1,55, 0, 1)} // Het eerste punt ligt op x = -2,25 μm en het laatste punt ligt op x = 37,75 μm
            ns { pt3dadd(37.75, -1.55, 0, 0.3) // De 3D coördinaten en de diameter voor de NS segmenten
            pt3dadd(127,75, -1,55, 0, 0,3)}
         2. Verschuif aan het einde van het bestand de 3D-coördinaat van het axon zodat het beginpunt het eindpunt van NS bereikt door het volgende te typen:
            axon {for i=0,n3d()-1 {pt3dchange(i, x3d(i)+130, y3d(i),z3d(i)-5, diam3d(i))}} //Shift the x-coordinate
         3. Verkort aan het einde van het bestand de dendritische compartimenten met 18% door het volgende te typen:
            forsec basaal {L=L*0,82} // De lengte schalen om de dendritische veldgrootte kleiner te maken
            define_shape() // Ontbrekende 3D-informatie invullen
2. Het aantal segmenten voor elke sectie definiëren
   OPMERKING: Elk deel van het neuron kan ruimtelijk worden gediscretiseerd, net als het proces van meshing in het FEM-model. De ruimtelijke discretisatie verdeelt het neuron vrijwel in kleinere segmenten waar berekeningen moeten worden uitgevoerd. Zorg er voor het aantal segmenten 'nseg' voor dat oneven getallen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat er een intern knooppunt in het midden van een celsectie is en probeer het nseg-getal te verdrievoudigen totdat de berekening een consistent resultaat oplevert⁹. Een groter aantal segmenten zal een nauwkeurigere numerieke benadering opleveren, maar verhoogt ook de rekenbelasting.
   1. Als voorbeeld van het discretisatieproces voegt u de volgende regels toe aan het bestand rgc.hoc om de neuronale secties in de somatische en axonale subsets in verschillende segmenten te verdelen:
      forsec somatisch {nseg=31}
      forsec axonaal {nseg=301}
      Andere secties in het model moeten ook worden gediscretiseerd door deze regels te typen, maar de naam van de subset (na 'forsec') en het aantal segmenten (na 'nseg') naar wens te wijzigen.
3. Plaats aangepaste ionkanaalmechanismen
   1. Aangepaste ionkanaalmechanismen schrijven als MOD-bestanden: Als u de ionkanaalmechanismen wilt toepassen, maakt u .mod-bestanden en voegt u de bestanden in het biofysische sectiegedeelte van het .hoc-bestand in door de stappen 3.3.1-3.3.3 te volgen. Het .mod-bestand bevat de variabelen en de differentiaalvergelijkingen die voor elk ionkanaal moeten worden opgelost.
      OPMERKING: Correcte ionkanaalmechanismedefinities en implementaties zijn van cruciaal belang bij nauwkeurige neuronsimulaties. Controleer bij het schrijven van .mod-bestanden of de eenheden correct zijn (het meegeleverde hulpprogramma 'modlunit' dat kan worden uitgevoerd om de eenheidsconsistentie te controleren) en of de vergelijkingen correct zijn geschreven. Om te testen of de ionkanaalmechanismen correct zijn, kan de stroom voor elk ionkanaal tijdens intracellulaire of extracellulaire stimulatie worden uitgezet en vergeleken met empirische bevindingen.
      1. Spanningsafhankelijke ionkanalen
         OPMERKING: Een .mod-bestand om een voltage-gated ionkanaal te maken, bevat meestal een DERIVATIVE-blok dat de differentiaalvergelijking moet oplossen, een BREAKPOINT-blok dat de opdrachten heeft om de differentiaalvergelijkingen op te lossen met behulp van een gekozen numerieke benaderingsmethode en PROCEDURE-blokken die het programma vertellen om de gatingparameters te berekenen (bijv. mt, ht en d in dit voorbeeld). Deze code berekent de waarden van de ionische stroom die door het kanaal gaat voor elke tijdstap.
         1. Als voorbeeld van het proces maakt u een spanningsafhankelijk Ca-kanaal met eerste-orde differentiaalvergelijkingen om op te lossen voor de gatingvariabelen.
         2. Open een nieuw bestand in de teksteditor en typ de regels in het aanvullende materiaal dat een spanningsafhankelijk Cat-kanaal definieert. Sla dit bestand op als Cat.mod in dezelfde map als het .hoc-bestand. Dit proces moet worden herhaald voor de andere ionkanalen die het modelneuron bevat.
      2. Spannings- en concentratieafhankelijke ionkanalen
         1. De kinetiek van sommige ionkanalen, zoals de calciumgeactiveerde kaliumkanalen in de retinale ganglioncellen, is afhankelijk van de intracellulaire calciumconcentratie naast de transmembraanspanning¹⁹. Als u dit type mechanisme wilt modelleren, maakt u een bestand met de naam KCa.mod en typt u de regels zoals weergegeven in aanvullende materiaalspannings- en concentratieafhankelijke ionkanalen. In dit .mod-bestand werd de variabele 'cai', die wordt gedefinieerd als de interne concentratie van Ca-ion, berekend en vervolgens wordt deze variabele in de vergelijking gebruikt om de iKCa-stroom te berekenen.
   2. Compilatie van .mod bestanden
      1. Compileer alle .mod-bestanden door het mknrndll-hulpprogramma van de neuron computational suite uit te voeren vanuit de installatiemap. Zoek de map waarin de MOD-bestanden zich bevinden en klik op compileren om O- en C-bestanden te maken. Hierna kunnen de mechanismen in dit celmodel worden ingevoegd.
   3. Toepassing van de .mod-bestanden in het hoofd-NEURON-modelbestand.
      OPMERKING: Naast het inbrengen van de ionkanalen, werd de maximale Na-geleiding alleen gedefinieerd voor de 'somatische' deelverzameling. We kunnen de maximale membraangeleiding voor verschillende neuronale segmenten indien nodig individueel aanpassen.
      1. Combineer kortheidshalve alle ionkanaalmechanismen tot één .mod-bestand (Supplementary Material-Complete .mod-bestand). Voeg het gecombineerde .mod-bestand met alle ionkanalen en een passief lekkanaal in alle segmenten in de 'somatische' subset in door de onderstaande regels te typen in de 'biophys'-procedure van het rgc.hoc-bestand:
         forsec somatic {rgcSpike invoegen
         insert pas // passief lekkanaal
         gnabar_rgcSpike = 80e-3
         g_pas = 0,008e-3 // lekmembraangeleiding}
   4. De axoplasmatische weerstand instellen
      1. De cellen hebben een axoplasmatische weerstand die per compartiment kan worden gewijzigd. Voor dit model hebben alle segmenten dezelfde weerstand van 110 Ω·cm. Wijzig de axoplasmatische weerstand in het bestand rgc.hoc:
         forall {Ra = 110}
4. Extracellulaire mechanismen invoegen en pulsgolfvorm definiëren
   1. Een extracellulair mechanisme in het celmodel invoegen
      1. Om het celmodel te laten reageren op extracellulaire spanning, plaatst u een extracellulair mechanisme in alle segmenten door de regel onder aan het bestand rgc.hoc te typen:
         forall {extracellulair invoegen}
   2. Een bifasische puls maken
      OPMERKING: In deze demonstratie wordt een constante stroom bifasische puls gemaakt die door de gebruiker instelbaar is in pulsbreedte, interfasekloof en het aantal herhalingen door een procedure in een .hoc-bestand te maken. Voor een meer gestructureerd programma gebruikt u het bestand rgc.hoc als een bestand om het celmodel te maken, terwijl het stimulatieproces wordt toegepast in een afzonderlijk .hoc-bestand, dat het celmodel laadt waarop de stimulatie wordt toegepast.
      1. Maak een nieuw tekstbestand met de naam stimulation.hoc en start de code door het celmodelbestand te laden; maak vervolgens een bifasische puls door een procedure te definiëren zoals weergegeven in Aanvullend materiaal - Een bifasische puls creëren in de neuronsimulatie.
         OPMERKING: Deze stap creëert een constante stroom kathodisch-eerste bifasische puls waarbij de stimulusparameters door de gebruiker moeten worden gedeclareerd bij het uitvoeren van de simulatie. Momenteel is de grootte van de anodische en kathodische pulsen ±1 μA, maar deze magnitude moet veranderen afhankelijk van de stimulatiestroom die door de schijfelektrode wordt geleverd.

4. Meerdere simulaties uitvoeren en automatiseren

1. De modellen combineren
   1. Het extraheren van de coördinaten voor de knooppunten in het neuroncelmodel
      OPMERKING: Het doel van het combineren van de simulaties is om de extracellulaire potentiële waarden te verkrijgen die overeenkomen met elk knooppunt van het celmodel. De coördinaten van de twee modellen moeten echter op elkaar worden afgestemd. In dit voorbeeld werd het middensegment van de soma (soma(0,5)) uitgelijnd om op het horizontale middenvlak van het netvliesweefsel te liggen (overeenkomend met de retinale ganglioncellaag), met de middelste knoop van de soma recht boven het midden van de schijfelektrode.
      1. Open het FEM-model en noteer de coördinaat van een referentiepunt (bijvoorbeeld het horizontale middenvlak van het netvliesweefsel, boven het midden van de schijfelektrode), in welk geval het [0, 0, 131,5] μm is.
      2. Maak in de neuron computational suite een bestand met de naam calculateCoord.hoc om de coördinaten van het centroïde van elk segment te extraheren en elke sectie te verschuiven zodat het middensegment van de soma dezelfde coördinaat heeft als het referentiepunt in het FEM-model (Supplementary Material-Calculating the coordinate of each node).
   2. De coördinaatpunten opslaan in een tekstbestand
      1. Voer het bestand calculateCoord.hoc uit (door te dubbelklikken vanuit de Verkenner of door de GUI van de neuron computational suite te openen; klik vervolgens op Bestand > laad hoc in de werkbalk). Sla de coördinaten voor de te evalueren extracellulaire spanningswaarden op in een tekstbestand met de naam 'coördinaten.dat'.
   3. Het uitvoeren van de simulaties en het opslaan van de spanningsgegevens in een tekstbestand
      OPMERKING: In deze stap hebben we de berekende extracellulaire waarden uit het FEM-model geëxtraheerd, maar we zouden de gegevens alleen opslaan van de relevante coördinaten die samenvallen met het centrum van elk celsegment. Volg stap 4.1.6.2 wanneer een groot aantal potentialen nodig is om te exporteren.
      1. Open het weefselmodelbestand in de FEM-software; ga naar de kop Resultaten in de modelstructuur en klik op Gegevens exporteren > gegevens > gegevens 1. Zorg ervoor dat de dataset is ingesteld op Studie 1/Parametrische oplossingen 1 en typ vervolgens 'V' in de kolom Expressie en 'mV' in de kolom Eenheid .
      2. Wijzig onder Uitvoer de bestandsnaam in extracellulair.dat en kies Punten om te evalueren in: Uit bestand. Laad de coördinaten.dat voor het veld Coördinaatbestand en klik vervolgens op Exporteren.
   4. De bifasische puls toepassen op het celmodel
      OPMERKING: In dit stadium zijn de extracellulaire spanningswaarden voor elk celsegment op één tijdstip (waar de stroom 1 μA is) beschikbaar. Aangezien de studie van plan is om de cel te onderwerpen aan een bifasische puls, moet de extracellulaire spanningswaarde die door de cel wordt ervaren, met de tijd veranderen met behulp van de 'vector.play'-methode.
      1. Voeg de lijnen toe die worden weergegeven in de aanvullende materiaaltoepassing van de bifasische puls in de stimulatie.hoc.
   5. De gecombineerde simulatie uitvoeren
      OPMERKING: Een tijdsinterval 'dt' voor de numerieke benaderingen moet worden gedefinieerd om de simulaties uit te voeren. Net als bij nseg kan een kortere dt de computationele nauwkeurigheid verhogen, maar ook de computationele kosten verhogen.
      1. Voeg de lijnen in het aanvullend materiaal -Het uitvoeren van de neuronsimulatie toe aan het einde van de stimulatie.hoc. Dubbelklik vervolgens op het bestand stimulation.hoc om het script te laden en de simulatie automatisch uit te voeren. Het transmembraanpotentieel van het interessante segment kan worden weergegeven in de GUI van de neuron computational suite (stap 4.2.1) of worden opgeslagen in een tekstbestand dat in andere programma's kan worden gelezen (stap 4.1.6.1.2). Volg de stappen 4.1.6.1 en 4.1.6.2 indien herhaalde berekeningen en een groot aantal membraanpotentialen moeten worden geëxporteerd.
   6. Extra: Simulaties automatiseren
      OPMERKING: Om een drempelamplitude te vinden, moet u de simulatie meerdere keren herhalen met telkens een andere stroomamplitude. Een andere automatisering kan nodig zijn om de drempel te vinden voor neuronen op verschillende posities ten opzichte van de stimulerende elektrode. Een automatiseringsstap kan worden uitgevoerd in de neuron computational suite met behulp van een procedure, evenals in de FEM-software met behulp van een script dat een 'methode' wordt genoemd.
      1. Automatisering van neuronsimulatie om een drempelamplitude te vinden
         OPMERKING: Een batch neuronsimulaties kan automatisch worden uitgevoerd. De volgende stappen worden geïmplementeerd in het neuronsimulatieprogramma om de drempelamplitudes van neuronen onder verschillende stimulatieparameters te vinden.
         1. Een procedure maken om simulatie te herhalen in het neuronsimulatieprogramma: Maak in stimulation.hoc een vector die een bereik van de huidige amplitude bevat om te testen. Maak vervolgens een procedure om de huidige amplitude toe te passen en registreer elke aanwezigheid van een piek (een positieve verandering van een negatieve naar een positieve transmembraanspanning) en de drempelamplitude wordt gedefinieerd als de laagste stroomamplitude die een piek veroorzaakt. Definieer hiervoor een procedure genaamd findTh() (Supplementary Material-Looping over een reeks stroomamplitudes) aan het einde van het bestand stimulation.hoc
         2. Het antwoord op de drempel opslaan in een tekstbestand: Voeg de volgende regels toe aan de procedure findTh() in de stimulation.hoc om de berekende transmembraanspanningswaarden voor alle neuroncompartimenten van elke tijdstap in een tekstbestand op te slaan:
            sprint(saveFileName, "Response_%d.dat", th) // Sla de drempelwaarde op
            saveFile.wopen(saveFileName)
            for i=0,(responseVector.size()-1){
            saveFile.printf("%g, ", responseVector.x[i])
            if(i==responseVector.size()-1) {saveFile.printf("%g\n", responseVector.x[i])
            saveFile.close(saveFileName)
            }}
      2. Automatisering in de FEM-software om de spanningswaarden voor neuronen op verschillende locaties te vinden
         OPMERKING: Een andere automatisering die kan worden gedaan, is de automatische verwerving van extracellulaire spanningswaarden voor neuronen op verschillende locaties. Het Menu Application Builder in de FEM-software biedt een middel om een 'methode' te definiëren, of een script om de stappen te automatiseren die de software nodig heeft om berekeningen uit te voeren. Om aan te tonen wordt de locatie van de cel in de x-richting 5 keer verschoven in een stap van 100 μm (aanvullende figuur 6).
         1. Het schrijven van een code voor automatiseringen van FEM simulaties.
            1. Ga naar de Application Builder, klik met de rechtermuisknop op Methoden in de Application Builder-structuur, kies Nieuwe methode en klik op OK. Ga naar > Voorkeuren > Methoden, vink het vakje Alle codes weergeven aan en klik op OK.
            2. Schrijf een .hoc script dat het coördinaatbestand laadt, verschuif de waarden naar de gewenste locatie en sla een tekstbestand op met de spanningswaarden voor de nieuwe locatie van de cel door de codes te typen die worden weergegeven in de methode Aanvullend materiaal definiëren om FEM-simulaties te automatiseren.
         2. De geautomatiseerde stappen uitvoeren in de FEM-software: Overschakelen naar de methode Model Builder, Developer > Uitvoeren > methode 1. Dit zal .dat bestanden produceren met de juiste spanningswaarden, genaamd extracellular_1.dat, extracellular_2.dat, enz.
      3. De simulaties herhalen in een programmeertaal voor algemene doeleinden
         OPMERKING: Om de simulaties te herhalen, moet het juiste tekstbestand elke keer worden geladen in de simulatie van de neuron computational suite, en een programmeertaal²⁰ die tekstbestanden gemakkelijk kan laden en manipuleren, is handig om deze stap uit te voeren. Elke handige geïntegreerde ontwikkelomgeving (IDE)²¹ kan voor deze stap worden gebruikt.
         1. Open de gekozen IDE, klik op Nieuw bestand om een nieuw script te maken. Hier wordt in dit voorbeeld een .py-bestand gebruikt. Typ de regels die worden weergegeven in Aanvullend materiaal - De simulaties uitvoeren in een programmeertaal voor algemene doeleinden.
         2. Klik ten slotte op Uitvoeren of druk op F5 om het script uit te voeren, waardoor ook de GUI wordt geopend (aanvullende afbeelding 7).
2. Weergave van simulatiegegevens
   OPMERKING: Door alle bovenstaande stappen te volgen, moeten de simulatieresultaten worden opgeslagen in tekstbestanden, met de drempelwaarde en de transmembraanpotentiaal op de drempel. De gebruiker heeft echter de mogelijkheid om het simulatieresultaat weer te geven terwijl de simulatie wordt uitgevoerd met behulp van de GUI van NEURON.
   1. Breng de reactie van het neuronmodel op de extracellulaire stimulatie in de GUI van de neuron computational suite in kaart. Om dit te doen, voert u stimulation.hoc uit, klikt u op Graph > Voltage Axis op de werkbalk en klikt u in het grafiekvenster met de rechtermuisknop ergens op en kiest u Plot What.
   2. Typ 'axon.v(1)' in het veld Variabele naar grafiek , wat betekent dat het de transmembraanpotentiaal van het laatste segment van het axon per tijdstap zal plotten.

Figuur 7: De FEM-berekeningsresultaten weergeven en exporteren naar een tekstbestand. Het venster Graphics toont een Multislice plot van de elektrische potentiaal in V. Met de opties in de instelling Voor gegevensexport konden de berekende variabele naar een tekstbestand worden geëxporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Weergave van de grafiek van de transmembraanpotentiaal met behulp van een spanningsgrafiek. Het neurontransmembraanpotentiaal werd weergegeven in de GUI van de neuron computational suite. De x-as is tijd in ms, terwijl de y-as de transmembraanpotentiaal is van het gekozen neuronsegment in mV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

We hebben twee simulatieprotocollen uitgevoerd om het gebruik van het model te demonstreren. Het eerste protocol omvatte het variëren van de elektrodegrootte terwijl de locatie van het neuron en de elektrische pulsparameters hetzelfde bleven. Het tweede protocol betrof het verschuiven van het neuron in de x-richting in stappen van 100 μm, terwijl de grootte van de elektrode constant bleef. Voor beide protocollen was de gebruikte puls een enkele kathodisch-eerste bifasische puls van 0,25 ms breedte met een interfasekloof van 0,05 ms. Voor het eerste protocol werd de straal van de elektrode gevarieerd tot 50, 150, 350 en 500 μm, terwijl voor het tweede protocol de straal van de elektrode op een constante 50 μm werd gehouden.

Het hier beschreven model toonde aan dat het verhogen van de suprachoroïdale elektrodegrootte bij 0,25 ms pulsbreedte de activeringsdrempel van het modelneuron verhoogde (figuur 9A). Dit resultaat weerspiegelde de in vivo bevindingen van Liang et al.12, die aantoonden dat de corticale activeringsdrempel toeneemt met de toenemende elektrodegrootte bij deze pulsbreedte.

De grootte van de activeringsdrempels van het model verschillen van de empirische bevindingen vanwege verschillende factoren. Ten eerste omvat dit model slechts een enkele RGC van een specifiek type, die mogelijk niet aanwezig is in de groep cellen die in de in vivo studie wordt geactiveerd. Vervolgens omvatte dit model geen retinaal netwerk, dat de activering van RGC's kan vergemakkelijken door exciterende inputs van de bipolaire cellen. Een andere mogelijke reden voor de discrepantie is de afstand tussen elektrode en netvlies. Het is mogelijk dat de elektrode-retina afstand in de in vivo studie lager was dan in dit model als gevolg van anatomische variabiliteit of de operatie. Bijgevolg hebben we de afstand tussen elektrode en netvlies en dus de activeringsdrempel overschat. Het is ook belangrijk op te merken dat, hoewel dit niet werd aangetoond in onze resultaten, het modelleren van een enkele celdrempel vaak de in vivo corticale drempel zou onderschatten. Dit komt door de technische beperkingen in corticale metingen (voornamelijk met betrekking tot de signaal-ruisverhouding) dat de corticale activiteit meestal pas wordt gedetecteerd nadat meerdere retinale ganglioncellen zijn geactiveerd. Als gevolg hiervan is een discrepantie in de grootte van de retinale en corticale activeringsdrempels te verwachten. Ondanks deze verschillen toonde dit model met succes de stijgende trend van de activeringsdrempel als gevolg van de toename van de elektrodegrootte. Dit was het gevolg van de afwezigheid van een gebied met een hoog elektrisch veld in vergelijking met de omgeving wanneer de elektrodegrootte wordt vergroot, wat de neurale activering niet bevorderde²².

Vervolgens hebben we de actiepotentiaalkenmerken waargenomen om het hier beschreven model te valideren. De latentie, of de tijd tussen het begin van de stimulus en de piek van de actiepotentiaalpiek, varieerde van 1-2,2 ms (figuur 9B). Dit kwam overeen met de korte latentie spiking als gevolg van niet-netwerk gemedieerde retinale activering²³. De spikebreedte van dit model was 1 ms, en dit is in hetzelfde bereik als de spikebreedtes van konijnenRGCs gemeten in vitro²⁴.

In het tweede stimulatieprotocol werd alleen de locatie van het neuron in de x-as (langs de lengte van het axon) ten opzichte van de elektrode gevarieerd. Op afstand 0 bevond het middelpunt van de somasectie zich direct boven het midden van de schijfelektrode. Negatieve afstand betekent dat de schijfelektrode dichter bij de axonale zijde werd geplaatst, terwijl positieve afstand betekent dat de schijfelektrode dichter bij de dendritische zijde werd geplaatst. Het model toonde aan dat de laagste drempel werd bereikt wanneer het smalle segment van het axon zich direct boven de schijfelektrode bevond, en het nam toe naarmate de x-afstand groter werd (figuur 9C). Het verder verplaatsen van de elektrode naar het distale axon produceerde een lagere drempel in vergelijking met het verplaatsen van de elektrode naar de dendrieten vanwege de aanwezigheid van het axon initiële segment en het smalle segment waar de natriumkanalen vaker voorkomen. Dit resultaat kwam overeen met de in vitro bevinding van Jensen et ^al.13, waarbij konijnenRGCs werden gestimuleerd met een ultrafijne micro-elektrode, en de activeringsdrempel het hoogst was wanneer de elektrode dichter bij de dendrieten werd verschoven.

Figuur 9: De resultaten van de modelleringsmethode. (A) De activeringsdrempels voor een retinale ganglioncel boven de schijfelektrode. De straal van de elektrode was gevarieerd (50, 150, 350 en 500 μm) en de drempel nam toe met toenemende elektrodegrootte. (B) De actiepotentiaalvorm van het neuronmodel bij een pulsbreedte van 0,25 ms. De actiepotentialen op drempel voor verschillende elektrodegroottes hebben dezelfde piekbreedte van 1 ms, maar de latentie nam toe met toenemende elektrodegrootte. De aanvangstijd van de stimulus was 1 ms en de kathodische fase veroorzaakte een depolarisatie aan het membraan, maar niet genoeg om een actiepotentiaal te veroorzaken. (C) Het neuron werd langs de x-as verschoven en de drempels van activering toonden aan dat de laagste drempel werd bereikt door het neuron waarvan het soma zich vlak boven het centrum van de elektrode bevond. De straal van de elektrode was 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Initialisatie van het eindige elementenmodel. De soorten studie en natuurkunde bepalen de lijst met vergelijkingen die in het model worden opgelost. Deze zijn ingesteld tijdens het initiële maken van het FEM-modelbestand, maar kunnen ook worden gewijzigd/toegevoegd nadat het model is gemaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: De lengte-eenheid wijzigen. De lengte-eenheid en hoekeenheid bepalen de eenheden die worden gebruikt in het geometriedefinitieproces. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Een materiaaleigenschap invoegen. De materiaaleigenschappen werden voor elk domein gedefinieerd in een 3D-model. De beschikbare materiaaleigenschappen zijn weergegeven in de materiaaleigenschappen in het venster Materiaalinstelling. Voor de berekening van de elektrische potentiaal werd alleen de elektrische geleidbaarheidseigenschap gedefinieerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Het maken van een parametrische studie om een lijst met parameterwaarden te herhalen. Een parametrische studie stelde de FEM-software in staat om de berekeningen automatisch te herhalen en de elektroderadiuswaarde voor elke herhaling te wijzigen. De berekeningsresultaten werden voor elke herhaling opgeslagen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: De morfologie van de neuronen importeren uit het SWC-bestand. De neuron computationele suite was in staat om SWC-bestanden te lezen die waren verkregen uit neuronale tracering. Het geïmporteerde bestand bevat informatie over de morfologie en topologie van elk neuronsegment. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Fem-bewerkingen automatiseren door een methode te definiëren. Een methode werd gedefinieerd door een script te schrijven om processen in de FEM-software te automatiseren die niet kunnen worden gedaan door een parametrische studie te definiëren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Integratie van de modellen en automatisering van de simulaties met behulp van een programmeertaal voor algemene doeleinden. De programmeertaal voor algemeen gebruik werd gebruikt om de neuronsimulaties te herhalen, terwijl het extracellulaire spanningsbestand dat als invoer werd gebruikt en het neurale responsspanningsbestand als uitvoer voor elke stap in de lus werd gewijzigd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend materiaal: Opdrachtregels voor (1) Het definiëren van een spanningsafhankelijk Cat kanaal. (2) Spannings- en concentratieafhankelijke ionkanalen. (3) Compleet .mod-bestand. (4) Het creëren van een bifasische puls in de neuronsimulatie. (5) Het berekenen van de coördinaat van elk knooppunt. (6) Toepassing van de bifasische puls. (7) Het uitvoeren van de neuronsimulatie. (8) Looping over een reeks stroomamplitudes. (9) Het definiëren van een methode om FEM-simulaties te automatiseren. (10) Het uitvoeren van de simulaties in een programmeertaal voor algemene doeleinden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In dit artikel hebben we een modelleringsworkflow gedemonstreerd die eindige elementen en biofysische neuronmodellering combineerde. Het model is zeer flexibel, omdat het in zijn complexiteit kan worden aangepast aan verschillende doeleinden, en het biedt een manier om de resultaten te valideren tegen empirische bevindingen. We hebben ook gedemonstreerd hoe we het model hebben geparametriseerd om automatisering mogelijk te maken.

De tweestapsmodelleringsmethode combineert de voordelen van het gebruik van FEM en neuron computational suite om de kabelvergelijking van het neuron op te lossen in de aanwezigheid van een extracellulaire stimulatie. Een FEM is nuttig bij het nauwkeurig berekenen van het extracellulaire veld over de volumegeleider, wat vaak onpraktisch op te lossen is in het geval van complexe geometrie of inhomogeniteit van geleidbaarheid. De rekenkosten van dit model zijn ook relatief laag, omdat wordt uitgegaan van een statische toestand.

Hoewel de beschreven modelleringsmethode voordelig is vanwege het gebruiksgemak en de flexibiliteit, zijn er beperkingen aan deze modelleringsworkflow. Ten eerste stond deze methode de aanwezigheid van een neuraal membraan bij het berekenen van het elektrische veld niet toe. Joucla et ^al.25 vergeleken de tweestappenmethode met de hele FEM-methode, waarbij de neurale geometrie en membraaneigenschappen werden opgenomen in het FEM-model. Ze toonden aan dat het opnemen van het neuron in de berekening van het elektrische veld de berekening van de transmembraanpotentiaal zou veranderen wanneer een grotere celstructuur, zoals een cellichaam, in de geometrie werd opgenomen. In het bijzonder betekent de vereenvoudiging van de neurongeometrie in de tweestappenmethode dat de transmembraanpotentiaal van elk punt in een compartiment wordt weergegeven door de transmembraanpotentiaal op het knooppunt of het middelpunt van het compartiment. Daarentegen bevatte het door Joucla voorgestelde whole-FEM-model een expliciete weergave van de 3D-geometrie van het neuron, waardoor de individuele evaluatie van transmembraanpotentiaal op elk punt in het compartiment mogelijk werd. Het hele FEM-model zou dus geschikter kunnen zijn als de exacte vorm en locatie van het transmembraanpotentiaal nodig zijn. Deze methode is echter rekenkundig duurder dan de tweestapsmethode.

De tweede beperking van de modelleringsmethode betreft de beschikbaarheid van morfologische en ionkinetische gegevens. Het hier gebruikte model was gebaseerd op de gegevens van de tijgersalamander, die is gebruikt om RGC's van andere soorten te modelleren, maar er kunnen verschillen zijn geweest in de soorten aanwezige ionkanalen die niet zijn opgehelderd. Daarom kan het in sommige gevallen nodig zijn om in vitro werken uit te voeren om de ionkanaalparameters aan te passen.

Ten derde kunnen de kosten van de FEM-software een beperking zijn. In dit geval kan een open-source FEM-programma²⁶ met een ingebouwde Poisson-vergelijkingsoplosser een alternatief zijn. Afgezien van de FEM-software die wordt gebruikt, is de software die in deze workflow wordt gebruikt gratis. Hoewel de gebruikte FEM-software een intuïtieve GUI en een kant-en-klare elektrische stroommodellering biedt, is het mogelijk om de extracellulaire waardeberekeningen uit te voeren in een programmeersoftware voor algemeen gebruik. Dit zou echter vereisen dat de fysische vergelijkingen en de numerieke methoden handmatig worden gedefinieerd om de vergelijkingen op te lossen²⁷. Bovendien kan deze methode vervelend zijn wanneer een complexe weefsel- of elektrode-arraygeometrie moet worden gebruikt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer workstation	N/A	N/A	Windows 64-bit operating system, at least 4GB of RAM, at least 3 GB of disk space
Anaconda Python	Anaconda Inc.	Version 3.9	The open source Individual Edition containing Python 3.9 and preinstalled packages to perform data manipulation, as well as Spyder Integrated Development Environment. It could be used to control the simulation, as well as to display and analyse the simulation data.
COMSOL Multiphysics	COMSOL	Version 5.6	The simulation suite to perform finite element modelling. The licence for the AC/DC module should be purchased. The Application Builder capability should be included in the licence to follow the automation tutorial.
NEURON	NEURON	Version 8.0	A freely-distributed software to perform the computation of neuronal cells and/or neural networks.