动态光散射分析用于测定铁-碳水化合物复合物的粒径

Summary

动态光散射（DLS）已成为评估静脉内施用的铁碳水化合物复合物的粒径和分布的合适测定方法。然而，这些协议缺乏标准化，需要针对分析的每个铁 – 碳水化合物复合物进行修改。本协议描述了蔗糖铁分析的应用和特殊注意事项。

Abstract

静脉注射的铁-碳水化合物纳米颗粒复合物广泛用于治疗缺铁。该类包括几种结构异质的纳米颗粒复合物，它们对可用于物理化学表征这些试剂的方法所需的条件表现出不同的敏感性。目前，铁-碳水化合物复合物的关键质量属性尚未完全确定。动态光散射（DLS）已成为确定完整粒径和分布的基本方法。然而，在实验室方法的标准化、单个铁碳水化合物产品所需的特定修改以及如何最好地描述尺寸分布方面仍然存在挑战。重要的是，使用的稀释剂和系列稀释液必须标准化。样品制备和数据报告方法的巨大差异限制了DLS用于铁碳水化合物制剂比较的使用。在本文中，我们详细介绍了一种稳健且易于重现的方案，以使用Z平均值和多分散指数测量铁 – 碳水化合物复合物蔗糖铁的大小和尺寸分布。

Introduction

蔗糖铁（IS）是一种胶体溶液，由多核氢氧化铁-氧氧核和蔗糖的复合物组成的纳米颗粒组成。IS被广泛用于治疗患有多种基础疾病状态的患者的缺铁，这些患者不能耐受口服补铁或口服铁剂无效^1。IS属于美国食品和药物管理局（FDA）定义的复杂药物类别，是一类具有与生物制剂²相称的复杂化学的药物。复杂药物产品的监管评估可能需要额外的正交理化方法和/或临床前或临床研究，以准确比较后续复杂药物^3,4。这很重要，因为一些研究报告说，使用IS与后续IS产品不会产生相同的临床结果。这强调了使用适用于^检测IS产品之间物理化学性质差异的新型正交表征技术的重要性^5,6。

准确阐明IS的大小和尺寸分布具有临床意义，因为粒径是调理率和程度的主要影响因素 – 这些复杂药物生物分布的第一个关键步骤^7,8。即使粒径和粒径分布的微小变化也与氧化铁纳米颗粒复合物^9,10的药代动力学特征的变化有关。Brandis 等人最近的一项研究表明，当比较参考列出的药物和通用葡萄糖酸铁钠产品时，通过 DLS 测量的粒径（14.9 nm ± 0.1 nm 与 10.1 nm ± 0.1 nm，p < 0.001）显着不同¹¹。铁碳水化合物产品的批次间质量、安全性和有效性的一致性完全取决于制造工艺的放大，必须仔细考虑潜在的制造漂移⁹.制造过程可能导致残留蔗糖，这将因制造商^{而异 12}.制造工艺变量的任何修改都可能导致最终复杂药物产品在结构、复合物稳定性和体内处置方面的重大^变化9。

为了评估药物的一致性并预测药物的体内行为，需要当代正交分析方法来确定复杂纳米药物的物理化学性质。然而，方法缺乏标准化，这可能导致结果报告在实验室间存在很大差异¹³。尽管全球监管机构和科学界认识到这些挑战¹⁴，但IS的大多数理化特征仍然定义不清，现有监管指导文件中的关键质量属性的全部补充尚未定义¹⁵。FDA发布的铁碳水化合物复合物特定产品指导文件草案建议将DLS作为评估后续产品的大小和大小分布的程序^16,17。

一些出版物详细介绍了已建立的DLS协议来确定IS纳米颗粒尺寸^13,18。但是，由于已发布方法的样品制备、程序条件、仪器和仪器设置参数不同，因此在没有标准化方法来解释结果的情况下，无法直接比较DLS结果^13,18。方法和数据报告方法的多样性限制了为比较目的对这些特征进行适当评估¹⁹.重要的是，之前发布的许多用于评估IS的DLS协议都没有考虑到蔗糖在悬浮液中扩散的影响，因为游离蔗糖的存在已被证明会虚假地提高胶体溶液中纳米颗粒的Z平均值计算的流体动力学半径^13,18。本协议旨在标准化测量IS粒径和分布的方法。该方法已为此目的而开发和验证。

Protocol

1. 操作机器 启动机器和软件注： 补充图 S1A-D 描述了启动机器和软件的步骤。在开始测量前至少 30 分钟打开仪器，然后启动 PC。 双击 仪器软件图标 以启动程序。 在登录窗口中输入用户名和密码。确保每个用户都有自己的帐户。 等待右下角的所有三个黑条都亮起绿色，表示设备已准备好运行。 在长时间不活…

Representative Results

所述方法根据ICH Q2（R1）20进行了验证，该方法涉及在不同条件下测量测试溶液。Z平均尺寸的精度仅为0.5%RSD，而PDI的计算最大RSD为3.5%。对于 Z 平均值大小，不同分析师和天数的平均结果仅相差 0.4%，PDI 相差 1.5%。统计数据是根据两位分析师在不同日期进行的 12 次测量计算得出的。测试浓度在50%-200%范围内的变化以及测试溶液在冷藏条件下储存长达5天都没有影响最终结果。 <p c…

Discussion

DLS已成为确定纳米颗粒尺寸和尺寸分布的基本方法，用于药物开发和监管评估。尽管DLS技术取得了进步，但在稀释剂选择和样品制备方面仍然存在方法学挑战，这与胶体溶液中的铁-碳水化合物复合物尤其相关。重要的是，铁碳水化合物纳米药物的DLS方法尚未在生物学环境（例如血浆）中得到广泛研究²²。因此，仍然迫切需要根据稀释剂的选择来协调最佳实践方案。稀释剂的选择?…

Materials

Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation