Análisis dinámico de dispersión de luz para la determinación del tamaño de partícula de complejos hierro-carbohidratos

Summary

La dispersión dinámica de la luz (DLS) se ha convertido en un ensayo adecuado para evaluar el tamaño de partícula y la distribución de los complejos hierro-carbohidratos administrados por vía intravenosa. Sin embargo, los protocolos carecen de estandarización y necesitan ser modificados para cada complejo hierro-carbohidratos analizado. El presente protocolo describe la aplicación y las consideraciones especiales para el análisis de la sacarosa de hierro.

Abstract

Los complejos de nanopartículas de hierro-carbohidratos administrados por vía intravenosa se usan ampliamente para tratar la deficiencia de hierro. Esta clase incluye varios complejos de nanopartículas estructuralmente heterogéneos, que exhiben una sensibilidad variable a las condiciones requeridas para las metodologías disponibles para caracterizar fisicoquímicamente estos agentes. Actualmente, los atributos críticos de calidad de los complejos hierro-carbohidratos no se han establecido completamente. La dispersión dinámica de luz (DLS) se ha convertido en un método fundamental para determinar el tamaño y la distribución de partículas intactas. Sin embargo, aún quedan desafíos con respecto a la estandarización de las metodologías en todos los laboratorios, las modificaciones específicas requeridas para productos individuales de hierro y carbohidratos y cómo se puede describir mejor la distribución del tamaño. Es importante destacar que el diluyente y las diluciones en serie utilizadas deben estandarizarse. La amplia varianza en los enfoques para la preparación de muestras y el informe de datos limita el uso de DLS para la comparación de agentes de carbohidratos de hierro. Aquí, detallamos un protocolo robusto y fácilmente reproducible para medir el tamaño y la distribución del tamaño del complejo hierro-carbohidratos, sacarosa de hierro, utilizando el promedio Z y el índice de polidispersidad.

Introduction

La sacarosa de hierro (IS) es una solución coloidal compuesta de nanopartículas que consiste en un complejo de un núcleo polinuclear de hierro-oxihidróxido y sacarosa. El IS se emplea ampliamente para tratar la deficiencia de hierro entre pacientes con una amplia variedad de estados de enfermedad subyacente que no toleran la suplementación oral de hierro o para quienes el hierro oral no es efectivo¹. IS pertenece a la clase de medicamentos complejos según lo definido por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), que es una clase de medicamentos con química compleja acorde con productos biológicos². La evaluación regulatoria de medicamentos complejos puede requerir métodos fisicoquímicos ortogonales adicionales y/o estudios preclínicos o clínicos para comparar con precisión los fármacos complejos de seguimiento ^3,4. Esto es importante porque varios estudios han informado que el uso de IS versus un producto de SI de seguimiento no produce los mismos resultados clínicos. Esto subraya la criticidad del uso de técnicas de caracterización novedosas y ortogonales que son adecuadas para detectar diferencias en las propiedades fisicoquímicas entre los productos de IS ^5,6.

La elucidación precisa del tamaño y la distribución del tamaño del SI es de importancia clínica, ya que el tamaño de las partículas es un factor influyente importante en la tasa y el alcance de la opsonización, el primer paso crítico en la biodistribución de estos fármacos complejos ^7,8. Incluso ligeras variaciones en el tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula se han relacionado con cambios en el perfil farmacocinético de complejos de nanopartículas de óxido de hierro ^9,10. Un estudio reciente de Brandis et al. mostró que el tamaño de partícula medido por DLS fue significativamente diferente (14,9 nm ± 0,1 nm vs. 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) al comparar un fármaco listado de referencia y un producto genérico de gluconato férrico de sodio, respectivamente¹¹. La calidad, seguridad y eficacia consistentes de lote a lote de los productos de carbohidratos de hierro dependen completamente de la ampliación del proceso de fabricación, y la posible deriva de fabricación debe considerarse cuidadosamente⁹. El proceso de fabricación puede resultar en sacarosa residual, y esto variará según el fabricante¹². Cualquier modificación en las variables del proceso de fabricación puede conducir a cambios significativos en el producto farmacéutico complejo final con respecto a la estructura, estabilidad compleja y disposición in vivo ⁹.

Para evaluar la consistencia del fármaco y predecir el comportamiento in vivo del fármaco, se requieren metodologías analíticas ortogonales contemporáneas para determinar las propiedades fisicoquímicas de las nanomedicinas complejas. Sin embargo, hay una falta de estandarización de las metodologías, lo que puede resultar en un alto grado de variación interlaboratorio en el reporte de resultados¹³. A pesar del reconocimiento de estos desafíos por parte de las autoridades reguladoras mundiales y la comunidad científica¹⁴, la mayoría de las características fisicoquímicas de los SI siguen estando mal definidas, y no se ha definido el complemento completo de atributos críticos de calidad en el contexto de los documentos de orientación regulatoria disponibles¹⁵. Los borradores de los documentos de orientación específicos del producto emitidos por la FDA para complejos hierro-carbohidratos sugieren DLS como un procedimiento para evaluar el tamaño y la distribución de tamaño de los productos de continuación^16,17.

Varias publicaciones han detallado protocolos DLS establecidos para determinar las dimensiones de las nanopartículas IS^13,18. Sin embargo, debido a que la preparación de la muestra, las condiciones del procedimiento, la instrumentación y los parámetros de configuración de la instrumentación son diferentes entre los métodos publicados, los resultados de DLS no pueden compararse directamente en ausencia de un método estandarizado para interpretar los resultados^13,18. La diversidad en las metodologías y los enfoques de presentación de datos limitan la evaluación adecuada de estas características con fines comparativos¹⁹. Es importante destacar que muchos de los protocolos DLS publicados anteriormente para evaluar el IS no tienen en cuenta el efecto de la difusión de sacarosa en la suspensión debido a la presencia de sacarosa libre, que ha demostrado elevar falsamente los radios hidrodinámicos calculados por el promedio Z de las nanopartículas en soluciones coloidales^13,18. El presente protocolo tiene como objetivo estandarizar la metodología para la medición del tamaño de partícula y la distribución del SI. El método ha sido desarrollado y validado para este propósito.

Protocol

1. Funcionamiento de la máquina Puesta en marcha de la máquina y el softwareNOTA: La figura suplementaria S1A-D describe los pasos para poner en marcha el equipo y el software.Encienda el instrumento al menos 30 minutos antes de comenzar las mediciones y luego inicie la PC. Haga doble clic en el icono del software del instrumento para iniciar el programa. Introduzca el nombre de usuario y la contraseña en la ventana de inici…

Representative Results

El método descrito fue validado de acuerdo con ICH Q2(R1)20, que implicó la medición de soluciones de prueba en condiciones variables. La precisión fue de solo 0.5% RSD para el tamaño promedio Z, mientras que se calculó un máximo de 3.5% RSD para el PDI. Los resultados medios de diferentes analistas y días solo difirieron en un 0,4% para el tamaño promedio Z y un 1,5% para el PDI. Las estadísticas se calcularon a partir de 12 mediciones realizadas por dos analistas en días variables. Ni…

Discussion

DLS se ha convertido en un ensayo fundamental para la determinación del tamaño y la distribución de tamaño de las nanopartículas para aplicaciones en el desarrollo de fármacos y la evaluación regulatoria. A pesar de los avances en las técnicas de DLS, todavía existen desafíos metodológicos con respecto a la selección de diluyentes y la preparación de muestras, que son especialmente relevantes para los complejos de hierro y carbohidratos en soluciones coloidales. Es importante destacar que los métodos de DLS…

Materials

Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation