Analisi dinamica della diffusione della luce per la determinazione della dimensione delle particelle dei complessi ferro-carboidrati

Summary

La diffusione dinamica della luce (DLS) è emersa come un test adatto per valutare la dimensione delle particelle e la distribuzione dei complessi ferro-carboidrati somministrati per via endovenosa. Tuttavia, i protocolli mancano di standardizzazione e devono essere modificati per ogni complesso ferro-carboidrati analizzato. Il presente protocollo descrive l’applicazione e le considerazioni speciali per l’analisi del saccarosio di ferro.

Abstract

I complessi di nanoparticelle ferro-carboidrati somministrati per via endovenosa sono ampiamente usati per trattare la carenza di ferro. Questa classe comprende diversi complessi di nanoparticelle strutturalmente eterogenei, che mostrano una sensibilità variabile alle condizioni richieste per le metodologie disponibili per caratterizzare fisicamente questi agenti. Attualmente, gli attributi critici di qualità dei complessi ferro-carboidrati non sono stati completamente stabiliti. La diffusione dinamica della luce (DLS) è emersa come un metodo fondamentale per determinare la dimensione e la distribuzione delle particelle intatte. Tuttavia, rimangono ancora sfide per quanto riguarda la standardizzazione delle metodologie tra i laboratori, le modifiche specifiche richieste per i singoli prodotti a base di carboidrati di ferro e il modo migliore per descrivere la distribuzione delle dimensioni. È importante sottolineare che le diluizioni diluente e seriali utilizzate devono essere standardizzate. L’ampia varianza negli approcci per la preparazione dei campioni e la segnalazione dei dati limita l’uso del DLS per il confronto degli agenti ferro-carboidrati. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo robusto e facilmente riproducibile per misurare le dimensioni e la distribuzione dimensionale del complesso ferro-carboidrati, il saccarosio di ferro, utilizzando la media Z e l’indice di polidispersità.

Introduction

Il saccarosio di ferro (IS) è una soluzione colloidale composta da nanoparticelle costituite da un complesso di un nucleo polinucleare di ferro-ossiidrossido e saccarosio. L’IS è ampiamente impiegato per trattare la carenza di ferro tra i pazienti con un’ampia varietà di stati patologici di base che non tollerano l’integrazione orale di ferro o per i quali il ferro orale non è efficace¹. L’IS appartiene alla classe di farmaci complessi come definita dalla Food and Drug Administration (FDA), che è una classe di farmaci con chimica complessa commisurata ai biologici². La valutazione regolatoria di farmaci complessi può richiedere ulteriori metodi fisico-chimici ortogonali e/o studi preclinici o clinici per confrontare accuratamente i farmaci complessi di follow-on ^3,4. Questo è importante perché diversi studi hanno riportato che l’uso di IS rispetto a un prodotto IS di follow-on non produce gli stessi risultati clinici. Ciò sottolinea la criticità dell’uso di tecniche di caratterizzazione nuove e ortogonali che sono adatte a rilevare differenze nelle proprietà fisico-chimiche tra i prodotti IS ^5,6.

La spiegazione accurata delle dimensioni e della distribuzione dimensionale dell’IS è di importanza clinica, poiché la dimensione delle particelle è un importante fattore influente nel tasso e nell’estensione dell’opsonizzazione – il primo passo critico nella biodistribuzione di questi farmaci complessi ^7,8. Anche lievi variazioni nella dimensione delle particelle e nella distribuzione granulometrica sono state correlate a cambiamenti nel profilo farmacocinetico dei complessi di nanoparticelle ferro-ossido ^9,10. Un recente studio di Brandis et al. ha mostrato che la dimensione delle particelle misurata dal DLS era significativamente diversa (14,9 nm ± 0,1 nm vs 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) quando si confrontava un farmaco elencato di riferimento e un generico gluconato ferrico di sodio, rispettivamente¹¹. La qualità, la sicurezza e l’efficacia costanti da lotto a lotto dei prodotti a base di carboidrati di ferro dipendono interamente dallo scale-up del processo di produzione e la potenziale deriva della produzione deve essere attentamente considerata⁹. Il processo di fabbricazione può causare saccarosio residuo e questo varierà in base al produttore¹². Qualsiasi modifica nelle variabili del processo di fabbricazione può portare a cambiamenti significativi nel prodotto farmaceutico complesso finale per quanto riguarda la struttura, la stabilità complessa e la disposizione in vivo ⁹.

Per valutare la coerenza del farmaco e prevedere il comportamento in vivo del farmaco, sono necessarie metodologie analitiche ortogonali contemporanee per determinare le proprietà fisico-chimiche di nanofarmaci complessi. Tuttavia, vi è una mancanza di standardizzazione delle metodologie, che può comportare un elevato grado di variazione interlaboratorio nella comunicazione dei risultati¹³. Nonostante il riconoscimento di queste sfide da parte delle autorità di regolamentazione globali e della comunità scientifica¹⁴, la maggior parte delle caratteristiche fisico-chimiche dell’IS rimane scarsamente definita e non è stata definita la piena gamma di attributi critici di qualità nel contesto dei documenti di orientamento normativi disponibili¹⁵. La bozza di documenti guida specifici del prodotto emessi dalla FDA per i complessi ferro-carboidrato suggerisce DLS come procedura per valutare le dimensioni e la distribuzione delle dimensioni dei prodotti di follow-on^16,17.

Diverse pubblicazioni hanno dettagliato i protocolli DLS stabiliti per determinare le dimensioni delle nanoparticelle IS^13,18. Tuttavia, poiché la preparazione del campione, le condizioni della procedura, la strumentazione e i parametri di impostazione della strumentazione sono diversi tra i metodi pubblicati, i risultati DLS non possono essere confrontati direttamente in assenza di un metodo standardizzato per interpretare i risultati^13,18. La diversità delle metodologie e degli approcci di comunicazione dei dati limita la valutazione appropriata di tali caratteristiche a fini comparativi¹⁹. È importante sottolineare che molti dei protocolli DLS precedentemente pubblicati per valutare l’IS non tengono conto dell’effetto della diffusione del saccarosio nella sospensione a causa della presenza di saccarosio libero, che ha dimostrato di elevare spuriamente i raggi idrodinamici calcolati in media Z delle nanoparticelle nelle soluzioni colloidali^13,18. Il presente protocollo mira a standardizzare la metodologia per la misurazione della dimensione delle particelle e della distribuzione di IS. Il metodo è stato sviluppato e convalidato a tale scopo.

Protocol

1. Utilizzo della macchina Avviamento della macchina e del softwareNOTA: la figura supplementare S1A-D descrive i passaggi per l’avvio della macchina e del software.Accendere lo strumento almeno 30 minuti prima di iniziare le misurazioni, quindi avviare il PC. Fare doppio clic sull’icona del software dello strumento per avviare il programma. Inserisci il nome utente e la password nella finestra di login. Assicurati che ogni ute…

Representative Results

Il metodo descritto è stato convalidato secondo ICH Q2(R1)20, che ha comportato la misurazione di soluzioni di prova in condizioni variabili. La precisione era solo dello 0,5% RSD per la dimensione media Z, mentre un massimo del 3,5% RSD è stato calcolato per il PDI. I risultati medi di diversi analisti e giorni differivano solo dello 0,4% per la dimensione media Z e dell’1,5% per il PDI. Le statistiche sono state calcolate da 12 misurazioni eseguite da due analisti in giorni diversi. Né le var…

Discussion

Il DLS è diventato un test fondamentale per la determinazione delle dimensioni e della distribuzione dimensionale delle nanoparticelle per applicazioni nello sviluppo di farmaci e nella valutazione normativa. Nonostante i progressi nelle tecniche DLS, esistono ancora sfide metodologiche per quanto riguarda la selezione del diluente e la preparazione del campione, che sono particolarmente rilevanti per i complessi ferro-carboidrati nelle soluzioni colloidali. È importante sottolineare che i metodi DLS per i nanofarmaci …

Materials

Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation