Dynamisk lysspredningsanalyse til bestemmelse af partikelstørrelsen af jern-kulhydratkomplekser

Summary

Dynamisk lysspredning (DLS) har vist sig som et egnet assay til evaluering af partikelstørrelsen og fordelingen af intravenøst administrerede jern-kulhydratkomplekser. Protokollerne mangler imidlertid standardisering og skal ændres for hvert jern-kulhydratkompleks, der analyseres. Denne protokol beskriver anvendelsen af og de særlige overvejelser ved analyse af jernsaccharose.

Abstract

Intravenøst administrerede jern-kulhydrat nanopartikelkomplekser anvendes i vid udstrækning til behandling af jernmangel. Denne klasse omfatter flere strukturelt heterogene nanopartikelkomplekser, som udviser varierende følsomhed over for de betingelser, der kræves for de metoder, der er tilgængelige til fysisk-kemisk karakterisering af disse midler. I øjeblikket er de kritiske kvalitetsegenskaber af jern-kulhydratkomplekser ikke fuldt ud etableret. Dynamisk lysspredning (DLS) er opstået som en grundlæggende metode til bestemmelse af intakt partikelstørrelse og fordeling. Der er dog stadig udfordringer med standardisering af metoder på tværs af laboratorier, specifikke ændringer, der kræves for individuelle jern-kulhydratprodukter, og hvordan størrelsesfordelingen bedst kan beskrives. Det er vigtigt, at det anvendte fortyndingsmiddel og serielle fortyndinger skal standardiseres. Den store variation i tilgange til prøveforberedelse og datarapportering begrænser brugen af DLS til sammenligning af jern-kulhydratmidler. Heri beskriver vi en robust og let reproducerbar protokol til måling af størrelse og størrelsesfordeling af jern-kulhydratkomplekset, jernsaccharose, ved hjælp af Z-gennemsnittet og polydispersitetsindekset.

Introduction

Jernsaccharose (IS) er en kolloid opløsning bestående af nanopartikler bestående af et kompleks af en polynuklear jernoxyhydroxidkerne og saccharose. IS er almindeligt anvendt til behandling af jernmangel blandt patienter med en bred vifte af underliggende sygdomstilstande, der ikke tåler oral jerntilskud, eller for hvem oralt jern ikke er effektivt¹. IS tilhører lægemiddelklassen af komplekse lægemidler som defineret af Food and Drug Administration (FDA), som er en klasse af lægemidler med kompleks kemi svarende til biologiske stoffer². Den regulatoriske evaluering af komplekse lægemiddelprodukter kan kræve yderligere ortogonale fysisk-kemiske metoder og/eller prækliniske eller kliniske undersøgelser for nøjagtigt at sammenligne opfølgende komplekse lægemidler ^3,4. Dette er vigtigt, fordi flere undersøgelser har rapporteret, at brugen af IS versus et opfølgende IS-produkt ikke giver de samme kliniske resultater. Dette understreger vigtigheden af brugen af nye og ortogonale karakteriseringsteknikker, der er egnede til at detektere forskelle i de fysisk-kemiske egenskaber mellem IS-produkter ^5,6.

Den nøjagtige belysning af størrelsen og størrelsesfordelingen af IS er af klinisk betydning, da partikelstørrelse er en vigtig indflydelsesrig faktor i hastigheden og omfanget af opsonisering – det første kritiske trin i biodistributionen af disse komplekse lægemidler ^7,8. Selv små variationer i partikelstørrelse og partikelstørrelsesfordeling har været relateret til ændringer i den farmakokinetiske profil af jernoxidnanopartikelkomplekser ^9,10. En nylig undersøgelse af Brandis et al. viste, at partikelstørrelse målt ved DLS var signifikant forskellig (14,9 nm ± 0,1 nm vs. 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001), når man sammenlignede henholdsvis et referenceopført lægemiddel og et generisk natriumjerngluconatprodukt¹¹. Den konsekvente batch-til-batch kvalitet, sikkerhed og effektivitet af jern-kulhydratprodukter er helt afhængig af fremstillingsprocessen opskalering, og potentiel fremstillingsdrift skal overvejes nøje⁹. Fremstillingsprocessen kan resultere i resterende saccharose, og dette vil variere afhængigt af producenten¹². Eventuelle ændringer i fremstillingsprocesvariablerne kan føre til betydelige ændringer i det endelige komplekse lægemiddelprodukt med hensyn til struktur, kompleks stabilitet og in vivo-disposition ⁹.

For at vurdere lægemidlets konsistens og forudsige lægemidlets in vivo-adfærd kræves moderne ortogonale analytiske metoder for at bestemme de fysisk-kemiske egenskaber ved komplekse nanolægemidler. Der mangler imidlertid standardisering af metoder, hvilket kan resultere i en høj grad af variation mellem laboratorier i resultatrapportering¹³. Selv om de globale tilsynsmyndigheder og det videnskabelige samfund har erkendt disse udfordringer¹⁴, er de fleste af IS’ fysisk-kemiske egenskaber fortsat dårligt defineret, og det fulde komplement af kritiske kvalitetsegenskaber i forbindelse med tilgængelige reguleringsmæssige vejledninger er ikke blevet defineret¹⁵. Udkastet til produktspecifikke vejledningsdokumenter udstedt af FDA for jern-kulhydratkomplekser foreslår DLS som en procedure til evaluering af størrelsen og størrelsesfordelingen af opfølgningsprodukter^16,17.

Flere publikationer har detaljeret etableret DLS-protokoller til bestemmelse af IS-nanopartikeldimensioner^13,18. Da parametrene for prøveforberedelse, procedurebetingelser, instrumentering og instrumentering imidlertid er forskellige blandt de offentliggjorte metoder, kan DLS-resultaterne ikke sammenlignes direkte, da der ikke findes en standardiseret metode til fortolkning af resultaterne^13,18. Forskellene i metoder og datarapporteringsmetoder begrænser den relevante evaluering af disse karakteristika til sammenligningsformål¹⁹. Det er vigtigt, at mange af de DLS-protokoller, der tidligere er offentliggjort for at evaluere IS, ikke tager højde for effekten af diffusionen af saccharose i suspensionen på grund af tilstedeværelsen af fri saccharose, som har vist sig at hæve nanopartiklernes Z-gennemsnitlige beregnede hydrodynamiske radier i kolloide opløsninger^13,18. Denne protokol har til formål at standardisere metoden til måling af partikelstørrelse og fordeling af IS. Metoden er udviklet og valideret til dette formål.

Protocol

1. Betjening af maskinen Start af maskine og softwareBEMÆRK: Supplerende figur S1A-D beskriver trinnene til start af maskinen og softwaren.Tænd for instrumentet mindst 30 minutter, før målingerne påbegyndes, og start derefter pc’en. Dobbeltklik på instrumentsoftwareikonet for at starte programmet. Indtast brugernavnet og adgangskoden i login-vinduet. Sørg for, at hver bruger har sin egen konto. Vent på, at al…

Representative Results

Den beskrevne metode blev valideret i henhold til ICH Q2(R1)20, som involverede måling af testopløsninger under forskellige forhold. Præcisionen var kun 0,5% RSD for Z-gennemsnitsstørrelsen, mens der maksimalt blev beregnet 3,5% RSD for PDI. De gennemsnitlige resultater fra forskellige analytikere og dage adskilte sig kun med 0,4% for Z-gennemsnitsstørrelsen og 1,5% for PDI. Statistikken blev beregnet ud fra 12 målinger udført af to analytikere på forskellige dage. Hverken ændringer i tes…

Discussion

DLS er blevet et grundlæggende assay til bestemmelse af størrelse og størrelsesfordeling af nanopartikler til applikationer inden for lægemiddeludvikling og lovgivningsmæssig evaluering. På trods af fremskridt inden for DLS-teknikker eksisterer der stadig metodologiske udfordringer med hensyn til valg af fortyndingsmiddel og prøveforberedelse, som er særligt relevante for jern-kulhydratkomplekser i kolloide opløsninger. Det er vigtigt, at DLS-metoder til jern-kulhydratnanomedicin endnu ikke er blevet undersøgt …

Materials

Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation