Criblage à haut débit d’isolats microbiens ayant un impact sur la santé de Caenorhabditis elegans

Summary

Les microbes intestinaux peuvent avoir un impact positif ou négatif sur la santé de leur hôte via des mécanismes spécifiques ou conservés. Caenorhabditis elegans est une plate-forme pratique pour dépister de tels microbes. Le présent protocole décrit le dépistage à haut débit de 48 isolats bactériens pour déterminer leur impact sur la résistance au stress des nématodes, utilisés comme indicateur de la santé des vers.

Abstract

Avec sa petite taille, sa courte durée de vie et sa génétique facile, Caenorhabditis elegans offre une plate-forme pratique pour étudier l’impact des isolats microbiens sur la physiologie de l’hôte. Il devient également fluorescent en bleu lors de la mort, fournissant un moyen pratique de localiser la mort. Cette propriété a été exploitée pour développer des tests de survie de C. elegans sans marquage à haut débit (LFASS). Celles-ci impliquent un enregistrement de fluorescence en accéléré des populations de vers placées dans des plaques multipuits, à partir desquelles le temps médian de mort de la population peut être déduit. La présente étude adopte l’approche LFASS pour dépister simultanément plusieurs isolats microbiens afin de déterminer les effets sur la sensibilité de C. elegans à la chaleur sévère et aux stress oxydatifs. Un tel pipeline de dépistage microbien, qui peut notamment être utilisé pour présélectionner les probiotiques, en utilisant une résistance sévère au stress comme indicateur de la santé de l’hôte, est rapporté ici. Le protocole décrit comment cultiver à la fois des collections d’isolats de microbiote intestinal de C. elegans et des populations de vers synchrones dans des réseaux multipuits avant de les combiner pour les essais. L’exemple fourni couvre l’analyse de 47 isolats bactériens et d’une souche témoin sur deux souches de vers, dans deux essais de stress en parallèle. Cependant, le pipeline d’approche est facilement évolutif et applicable à l’examen de nombreuses autres modalités. Ainsi, il fournit une configuration polyvalente pour étudier rapidement un paysage multiparamétrique de conditions biologiques et biochimiques qui ont un impact sur la santé de C. elegans.

Introduction

Le corps humain abrite environ 10 à 100 billions de cellules microbiennes vivantes (bactéries, champignons archées), qui se trouvent principalement dans les environnements intestinaux, cutanés et muqueux¹. Dans un état sain, ceux-ci offrent des avantages à leur hôte, y compris la production de vitamines, la maturation du système immunitaire, la stimulation des réponses immunitaires innées et adaptatives aux agents pathogènes, la régulation du métabolisme des graisses, la modulation des réponses au stress, etc., avec un impact sur la croissance et le développement, l’apparition de la maladie et le vieillissement 2,3,4,5 . Le microbiote intestinal évolue également considérablement tout au long de la vie. L’évolution la plus radicale se produit pendant la petite enfance et la petite enfance⁶, mais des changements significatifs se produisent également avec l’âge, notamment une diminution de l’abondance de Bifidobacterium et une augmentation des espèces de Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae et Enterococcus ⁷. Le mode de vie peut altérer davantage la composition microbienne intestinale conduisant à une dysbiose (perte de bactéries bénéfiques, prolifération de bactéries opportunistes), entraînant diverses pathologies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, le diabète et l’obésité⁵, mais contribuant également aux maladies d’Alzheimer et de Parkinson 8,9,10,11.

Cette prise de conscience a contribué de manière critique à affiner le concept de l’axe intestin-cerveau (ACS), où les interactions entre la physiologie intestinale (y compris maintenant les microbes qu’elle contient) et le système nerveux sont considérées comme le principal régulateur du métabolisme animal et des fonctions physiologiques¹². Cependant, le rôle précis du microbiote dans la signalisation intestin-cerveau et les mécanismes d’action associés sont loin d’être entièrement compris¹³. Le microbiote intestinal étant un déterminant clé du vieillissement en bonne santé, la façon dont les bactéries modulent le processus de vieillissement est devenue un sujet de recherche intense et de controverse 6,14,15.

Avec la démonstration que le ver rond Caenorhabditis elegans héberge un véritable microbiote intestinal dominé – comme chez d’autres espèces – par Bacteroidetes, Firmicutes, et Actinobacteria 16,17,18,19,20, son ascension rapide en tant que plate-forme expérimentale pour étudier les interactions commensales hôte-intestin^21,22,23,24 ,^25,26 a considérablement élargi notre arsenal d’enquête^26,27,28,29. En particulier, les approches expérimentales à haut débit disponibles pour C. elegans pour étudier les interactions gène-alimentation, gène-médicament, gène-pathogène, etc., peuvent être adaptées pour explorer rapidement l’impact des isolats et des cocktails bactériens sur la santé et le vieillissement de C. elegans.

Le présent protocole décrit un pipeline expérimental permettant de dépister immédiatement des réseaux d’isolats ou de mélanges bactériens placés dans des plaques multipuits pour déterminer les effets sur la résistance au stress de C. elegans en tant qu’indicateur de la santé, ce qui peut être utilisé pour identifier les probiotiques. Il explique comment développer de grandes populations de vers et manipuler des réseaux bactériens dans des formats de plaques à 96 et 384 puits avant de traiter les vers pour une analyse automatisée de la résistance au stress à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence (Figure 1). L’approche est basée sur des tests de survie automatisés sans marquage (LFASS)³⁰ qui exploitent le phénomène de fluorescence de mort³¹, par lequel les vers mourants produisent une explosion de fluorescence bleue qui peut être utilisée pour déterminer le moment de la mort. La fluorescence bleue est émise par les esters glucosyles de l’acide anthranilique stockés dans les granules intestinaux de C. elegans (un type d’organite apparenté au lysosome), qui éclatent lorsqu’une cascade nécrotique est déclenchée dans l’intestin du ver à la mort³¹.

Figure 1 : Flux de travail expérimental pour le criblage à haut débit d’isolats bactériens ayant un impact sur la résistance de C. elegans au stress. (A) Calendrier pour l’entretien et la mise en place des tests vers et bactériens. (B) Installation et manipulation de réseaux de plaques bactériennes à 96 puits. (C) Installation de plaques à vis sans fin à 384 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Les deux souches de C. elegans utilisées en parallèle pour la présente étude étaient Bristol N2 de type sauvage et HT1890: daf-16 (mgDf50), qui croissent à des taux similaires. Cependant, le protocole peut être reproduit avec n’importe quelle combinaison de deux souches qui ont des taux de croissance similaires. Notez que, lors de l’essai d’autres souches en parallèle (par exemple, les mutants daf-2 de type sauvage et à croissance lente), des taux de croissance différents doiven…

Representative Results

Les tests LFASS fournissent un criblage robuste, à haut débit et rapide de plusieurs conditions de test à la fois, telles que le criblage de nombreux paramètres génétiques et microbiotiques qui contribuent à la résistance au stress et au vieillissement. Il ne faut que 2 à 3 semaines à l’expérience pour acquérir un vaste ensemble de données de plusieurs conditions de test. Les populations adultes de vers de type sauvage L4 + 36 h ont été exposées à un stress thermique de 42 °C et à un stress …

Discussion

C. elegans offre de nombreux avantages pour le criblage rapide de plusieurs paramètres expérimentaux à la fois, en raison de sa petite taille, de sa transparence, de son développement rapide, de sa courte durée de vie, de son faible coût et de sa facilité de manipulation. Son génome, son plan corporel, son système nerveux, son intestin et son microbiome considérablement plus simples, mais suffisamment complexes et similaires à ceux des humains, en font un modèle préclinique puissant, où des informa…

Materials

10 cm diameter plates (Non-vented)	Fisher Scientific	10720052	Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	168381
384-well black, transparent flat bottom plates	Corning	3712 or 3762	Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	150288	Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite)	Thermo	130188
Agar (<4% ash)	Sigma-Aldrich	102218041	Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP	Beckman coulter
Bleach	Honeywell	425044
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5080
Centrifuge 5415 R	Eppendorf
Centrifuge 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB broth	Invitrogen	12795084
LoBind tips	VWR	732-1488	Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes	Eppendorf	22431081
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+	Tecan		Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark	Tecan
Potassium phosphate monobasic	Honeywell	P0662
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base	Leica	MZ6, or M80	Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)	Sigma-Aldrich	458139
Transparent adhesive seals Nunc	Fisher Scientific	101706871	It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422