חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.
עם גודלו הקטן, תוחלת החיים הקצרה והגנטיקה הקלה שלו, Caenorhabditis elegans מציע פלטפורמה נוחה לחקר ההשפעה של מבודדים מיקרוביאליים על הפיזיולוגיה של המארח. הוא גם פלואורסצנטי בכחול בעת המוות, ומספק אמצעי נוח לאיתור מוות. נכס זה נוצל לפיתוח מבחני הישרדות C. elegans ללא תוויות בתפוקה גבוהה (LFASS). אלה כוללים רישום פלואורסצנטי בהילוך מהיר של אוכלוסיות תולעים הקבועות בלוחות מרובי בתים, שמהם ניתן לגזור את זמן המוות החציוני של האוכלוסייה. המחקר הנוכחי מאמץ את גישת LFASS לסינון מבודדים מיקרוביאליים מרובים בו-זמנית עבור ההשפעות על הרגישות של C. elegans לחום חמור ולעקות חמצוניות. כאן מדווח על צינור סינון מיקרוביאלי כזה, שניתן להשתמש בו בעיקר כדי לסנן מראש פרוביוטיקה, תוך שימוש בעמידות קשה ללחץ כפרוקסי לבריאות המארח. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל הן את אוספי המיקרוביוטה המבודדת של המעיים C. elegans והן אוכלוסיות תולעים סינכרוניות במערכים מרובי תאים לפני שילובם למבחנים. הדוגמה שסופקה מכסה בדיקה של 47 חיידקים מבודדים וזן בקרה אחד על שני זני תולעים, בשני מבחני עקה במקביל. עם זאת, צינור הגישה ניתן להרחבה בקלות וישים לסינון של שיטות רבות אחרות. לפיכך, הוא מספק מערך רב-תכליתי לסקירה מהירה של נוף רב-פרמטרי של תנאים ביולוגיים וביוכימיים המשפיעים על בריאות C. elegans.
בגוף האדם חיים כ-10-100 טריליון תאים מיקרוביאליים חיים (חיידקים, פטריות ארכאיות), המצויים בעיקר בסביבות המעיים, העור והרירית1. במצב בריא, אלה מספקים יתרונות למארח שלהם, כולל ייצור ויטמינים, התבגרות של מערכת החיסון, גירוי של תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות לפתוגנים, ויסות חילוף החומרים של השומן, ויסות תגובות ללחץ ועוד, עם השפעה על גדילה והתפתחות, התפרצות מחלות והזדקנות 2,3,4,5 . גם המיקרוביוטה של המעיים מתפתחת במידה ניכרת במהלך החיים. האבולוציה הדרסטית ביותר מתרחשת במהלך הינקות והילדות המוקדמת6, אך שינויים משמעותיים מתרחשים גם עם הגיל, כולל ירידה בשפע ביפידובקטריום ועלייה במינים קלוסטרידיום, לקטובצילוס, אנטרובקטריה ואנטרוקוקוס 7. אורח חיים יכול לשנות עוד יותר את ההרכב המיקרוביאלי של המעיים ולהוביל לדיסביוזיס (אובדן חיידקים מועילים, צמיחת יתר של חיידקים אופורטוניסטיים), וכתוצאה מכך פתולוגיות שונות כגון מחלות מעי דלקתיות, סוכרת והשמנת יתר5, אך גם לתרום למחלות אלצהיימר ופרקינסון 8,9,10,11.
הבנה זו תרמה תרומה קריטית לעידון הרעיון של ציר המעי-מוח (GBA), שבו אינטראקציות בין הפיזיולוגיה של המעיים (כיום כולל המיקרובים שבתוכה) לבין מערכת העצבים נחשבות לווסת העיקרי של חילוף החומרים של בעלי החיים ולתפקודים פיזיולוגיים12. עם זאת, התפקיד המדויק של המיקרוביוטה באיתות בין המעי למוח ומנגנוני הפעולה הקשורים אליו רחוקים מלהיות מובנים במלואם13. מאחר שמיקרוביוטה של המעיים היא גורם מפתח להזדקנות בריאה, האופן שבו חיידקים מווסתים את תהליך ההזדקנות הפך לנושא למחקר אינטנסיבי ולמחלוקת 6,14,15.
עם ההדגמה שהתולעת העגולה Caenorhabditis elegans מארחת מיקרוביוטה של המעי בונפיד הנשלטת – כמו במינים אחרים – על ידי Bacteroidetes, Firmicutes ו- Actinobacteria 16,17,18,19,20, עלייתה המהירה כפלטפורמה ניסיונית לחקר אינטראקציות בין המעי המארח למעיים 21,22,23,24 ,25,26 הרחיב משמעותית את ארסנל החקירות שלנו26,27,28,29. בפרט, ניתן להתאים גישות ניסיוניות בעלות תפוקה גבוהה הזמינות עבור C. elegans לחקר תזונה גנטית, גנים-תרופות, גנים-פתוגנים וכו’, כדי לחקור במהירות כיצד חיידקים מבודדים וקוקטיילים משפיעים על הבריאות וההזדקנות של C. elegans.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר צינור ניסיוני לסינון בבת אחת של מערכים של חיידקים מבודדים או תערובות שנקבעו בלוחות מרובי בתים להשפעות על עמידות ללחץ C. elegans כפרוקסי לבריאות, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות פרוביוטיקה. הוא מפרט כיצד לגדל אוכלוסיות תולעים גדולות ולטפל במערכי חיידקים בתבניות של לוחות 96 ו-384 בארות לפני עיבוד תולעים לניתוח אוטומטי של עמידות בפני עקה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים (איור 1). הגישה מבוססת על מבחני הישרדות אוטומטיים ללא תוויות (LFASS)30 המנצלים את תופעת פלואורסצנציית המוות31, לפיה תולעים גוססות מייצרות פרץ של פלואורסצנציה כחולה שניתן להשתמש בה כדי לאתר את זמן המוות. פלואורסצנציה כחולה נפלטת על ידי אסטרים של גלוקוזיל של חומצה אנתרנילית המאוחסנים בגרגרי מעיים של C. elegans (סוג של אברונים הקשורים לליזוזום), אשר מתפוצצים כאשר מפל נמק מופעל במעי התולעת עם המוות31.
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית לסינון בתפוקה גבוהה של חיידקים מבודדים עם השפעה על עמידות C. elegans ללחץ . (A) ציר זמן לתחזוקה והגדרת בדיקה של תולעים וחיידקים. (B) מערך לוחות חיידקים 96 באר התקנה וטיפול. (C) 384-באר צלחת תולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
C. elegans מציעה יתרונות רבים לסינון מהיר של מספר פרמטרים ניסיוניים בו זמנית, בשל גודלה הקטן, השקיפות, הפיתוח המהיר, תוחלת החיים הקצרה, הזולות וקלות הטיפול. הגנום, תוכנית הגוף, מערכת העצבים, המעיים והמיקרוביום הפשוטים הרבה יותר, אך מורכבים ודומים מספיק לבני אדם, הופכים אותו למודל פרה-קליני ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ל- CGC מינסוטה (מדיסון, ארה”ב, NIH – P40 OD010440) על אספקת זני תולעים ו- OP50 ו- Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, קיל, גרמניה) על אספקת כל המבודדים המיקרוביאליים הסביבתיים המתוארים כאן. עבודה זו מומנה על ידי מענק UKRI-BBSRC ל-AB (BB/S017127/1). JM ממומן על ידי מלגת דוקטורט FHM של אוניברסיטת לנקסטר.
10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
Bleach | Honeywell | 425044 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB agar | Difco | 240110 | |
LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
Plate reader- Spark | Tecan | ||
Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |