Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Summary

I microbi intestinali possono avere un impatto positivo o negativo sulla salute del loro ospite attraverso meccanismi specifici o conservati. Caenorhabditis elegans è una comoda piattaforma per lo screening di tali microbi. Il presente protocollo descrive lo screening ad alto rendimento di 48 isolati batterici per l’impatto sulla resistenza allo stress dei nematodi, utilizzati come proxy per la salute dei vermi.

Abstract

Con le sue piccole dimensioni, la breve durata della vita e la facile genetica, Caenorhabditis elegans offre una comoda piattaforma per studiare l’impatto degli isolati microbici sulla fisiologia dell’ospite. Fluorescente anche in blu quando muore, fornendo un mezzo conveniente per individuare la morte. Questa proprietà è stata sfruttata per sviluppare saggi di sopravvivenza di C. elegans (LFASS) label-free ad alto rendimento. Questi comportano la registrazione della fluorescenza time-lapse delle popolazioni di vermi impostate in piastre multipozzetto, da cui può essere derivato il tempo mediano di morte della popolazione. Il presente studio adotta l’approccio LFASS per lo screening di più isolati microbici contemporaneamente per gli effetti sulla suscettibilità di C. elegans al calore severo e agli stress ossidativi. Tale pipeline di screening microbico, che può essere utilizzata in particolare per preselezionare i probiotici, utilizzando una grave resistenza allo stress come proxy per la salute dell’ospite è riportata qui. Il protocollo descrive come far crescere sia le collezioni di isolati di microbiota intestinale di C. elegans che le popolazioni di vermi sincroni in array multipozzetti prima di combinarli per i test. L’esempio fornito copre il test di 47 isolati batterici e un ceppo di controllo su due ceppi di vermi, in due saggi di stress in parallelo. Tuttavia, la pipeline di approccio è facilmente scalabile e applicabile allo screening di molte altre modalità. Pertanto, fornisce una configurazione versatile per esaminare rapidamente un panorama multiparametrico di condizioni biologiche e biochimiche che influiscono sulla salute di C. elegans.

Introduction

Il corpo umano ospita circa 10-100 trilioni di cellule microbiche vive (batteri, funghi archaea), che si trovano principalmente negli ambienti dell’intestino, della pelle e delle mucose¹. In uno stato sano, questi forniscono benefici al loro ospite, tra cui la produzione di vitamine, la maturazione del sistema immunitario, la stimolazione delle risposte immunitarie innate e adattative agli agenti patogeni, la regolazione del metabolismo dei grassi, la modulazione delle risposte allo stress e altro ancora, con un impatto sulla crescita e lo sviluppo, l’insorgenza della malattia e l’invecchiamento 2,3,4,5 . Anche il microbiota intestinale si evolve considerevolmente nel corso della vita. L’evoluzione più drastica si verifica durante l’infanzia e la prima infanzia⁶, ma cambiamenti significativi si verificano anche con l’età, tra cui una diminuzione dell’abbondanza di Bifidobacterium e un aumento di Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae e Enterococcus specie⁷. Lo stile di vita può alterare ulteriormente la composizione microbica intestinale portando alla disbiosi (perdita di batteri benefici, crescita eccessiva di batteri opportunisti), causando varie patologie come malattie infiammatorie intestinali, diabete e obesità⁵, ma anche contribuendo alle malattie di Alzheimer e Parkinson 8,9,10,11.

Questa consapevolezza ha contribuito in modo critico ad affinare il concetto di asse intestino-cervello (GBA), dove le interazioni tra la fisiologia intestinale (ora inclusi i microbi al suo interno) e il sistema nervoso sono considerate il principale regolatore del metabolismo animale e delle funzioni fisiologiche¹². Tuttavia, il ruolo preciso del microbiota nella segnalazione intestino-cervello e i meccanismi d’azione associati sono lontani dall’essere pienamente compresi¹³. Con il microbiota intestinale che è un determinante chiave dell’invecchiamento sano, il modo in cui i batteri modulano il processo di invecchiamento è diventato oggetto di intense ricerche e polemiche 6,14,15.

Con la dimostrazione che il nematode Caenorhabditis elegans ospita un microbiota intestinale in buona fede dominato – come in altre specie – da Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria 16,17,18,19,20, la sua rapida ascesa come piattaforma sperimentale per studiare le interazioni commensali ospite-intestino^21,22,23,24 ,^25,26 ha notevolmente ampliato il nostro arsenale investigativo^26,27,28,29. In particolare, gli approcci sperimentali ad alto rendimento disponibili per C. elegans per studiare le interazioni gene-dieta, gene-farmaco, gene-patogeno, ecc., possono essere adattati per esplorare rapidamente come isolati e cocktail batterici influenzano la salute e l’invecchiamento di C. elegans.

Il presente protocollo descrive una pipeline sperimentale per lo screening simultaneo di array di isolati o miscele batteriche impostati in piastre multipozzetto per gli effetti sulla resistenza allo stress di C. elegans come proxy per la salute, che può essere utilizzato per identificare i probiotici. Descrive in dettaglio come far crescere grandi popolazioni di vermi e gestire array batterici in formati di piastre a 96 e 384 pozzetti prima di elaborare i vermi per l’analisi automatizzata della resistenza allo stress utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (Figura 1). L’approccio si basa su saggi di sopravvivenza automatizzati label-free (LFASS)³⁰ che sfruttano il fenomeno della fluorescenza di morte³¹, per cui i vermi morenti producono un’esplosione di fluorescenza blu che può essere utilizzata per individuare il momento della morte. La fluorescenza blu è emessa dagli esteri glucosilici dell’acido antranilico immagazzinati nei granuli intestinali di C. elegans (un tipo di organello correlato al lisosoma), che scoppiano quando una cascata necrotica viene innescata nell’intestino del verme alla morte³¹.

Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale per lo screening ad alta produttività di isolati batterici con impatto sulla resistenza allo stress di C. elegans . (A) Cronologia per la manutenzione di vermi e batteri e la configurazione del test. (B) Configurazione e gestione dell’array di piastre batteriche a 96 pozzetti. (C) Configurazione della piastra a vite senza fine a 384 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

I due ceppi di C. elegans utilizzati in parallelo per il presente studio erano Bristol N2 wild type e HT1890: daf-16 (mgDf50), che crescono a tassi simili. Tuttavia, il protocollo può essere replicato con qualsiasi combinazione di due ceppi che hanno tassi di crescita simili. Si noti che, quando si testano altri ceppi in parallelo (ad esempio, mutanti daf-2 wild type e a crescita lenta), devono essere considerati diversi tassi di crescita e, di conseguenza, il protocollo deve essere adattato. …

Representative Results

I test LFASS forniscono uno screening robusto, ad alto rendimento e rapido di più condizioni di test contemporaneamente, come lo screening di numerosi parametri genetici e del microbiota che contribuiscono alla resistenza allo stress e all’invecchiamento. Ci vogliono solo 2-3 settimane perché l’esperimento acquisisca un ampio set di dati di più condizioni di test. Le popolazioni adulte di vermi selvatici L4 + 36 h sono state esposte a stress termico a 42 °C e stress ossidativo indotto da t-BHP del 7% dopo un…

Discussion

C. elegans offre molti vantaggi per lo screening rapido di più parametri sperimentali contemporaneamente, grazie alle sue dimensioni ridotte, trasparenza, sviluppo rapido, breve durata, economicità e facilità di manipolazione. Il suo genoma considerevolmente più semplice, il piano corporeo, il sistema nervoso, l’intestino e il microbioma, ma complessi e abbastanza simili agli esseri umani, lo rendono un potente modello preclinico, in cui è possibile ottenere informazioni meccanicistiche durante i test di ef…

Materials

10 cm diameter plates (Non-vented)	Fisher Scientific	10720052	Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	168381
384-well black, transparent flat bottom plates	Corning	3712 or 3762	Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	150288	Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite)	Thermo	130188
Agar (<4% ash)	Sigma-Aldrich	102218041	Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP	Beckman coulter
Bleach	Honeywell	425044
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5080
Centrifuge 5415 R	Eppendorf
Centrifuge 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB broth	Invitrogen	12795084
LoBind tips	VWR	732-1488	Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes	Eppendorf	22431081
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+	Tecan		Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark	Tecan
Potassium phosphate monobasic	Honeywell	P0662
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base	Leica	MZ6, or M80	Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)	Sigma-Aldrich	458139
Transparent adhesive seals Nunc	Fisher Scientific	101706871	It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422