تحريض التهاب سطح العين وجمع الأنسجة المصابة
Summary
التهاب سطح العين يضر بأنسجة سطح العين ويضر بالوظائف الحيوية للعين. يصف البروتوكول الحالي طريقة للحث على التهاب العين وجمع الأنسجة المعرضة للخطر في نموذج فأر لخلل في غدة ميبوميان (MGD).
Abstract
تشمل أمراض سطح العين مجموعة من الاضطرابات التي تزعج وظائف وهياكل القرنية والملتحمة وشبكة الغدد السطحية للعين المرتبطة بها. تفرز غدد ميبوميان (MG) الدهون التي تخلق طبقة تغطية تمنع تبخر الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع. تملأ العدلات ومصائد الحمض النووي خارج الخلية MG وسطح العين في نموذج فأر لمرض حساسية العين. تقوم مصائد العدلات المجمعة خارج الخلية (aggNETs) بصياغة مصفوفة تشبه الشبكة تتكون من كروماتين خارج الخلية يسد منافذ MG ويعالج خلل MG. هنا ، يتم تقديم طريقة للحث على التهاب سطح العين وضعف MG. يتم وصف إجراءات جمع الأعضاء المتعلقة بسطح العين ، مثل القرنية والملتحمة والجفون ، بالتفصيل. باستخدام التقنيات المعمول بها لمعالجة كل عضو ، يتم أيضا عرض السمات المورفولوجية والنسيجية الرئيسية لخلل MG. توفر الإفرازات العينية الفرصة لتقييم الحالة الالتهابية لسطح العين. تتيح هذه الإجراءات التحقيق في التدخلات الموضعية والجهازية المضادة للالتهابات على المستوى قبل السريري.
Introduction
كل غمضة عين تغذي الغشاء المسيل للدموع الناعم المنتشر فوق القرنية. تسهل ظهارة سطح العين التوزيع والاتجاه الصحيح للفيلم المسيل للدموع على سطح العين. يتم توفير الميوسين بواسطة الخلايا الظهارية للقرنية والملتحمة للمساعدة في وضع الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع القادم من الغدد الدمعية على سطح العينين. أخيرا ، يفرز MG الدهون التي تخلق طبقة تغطية تمنع تبخر الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع1،2،3. بهذه الطريقة ، تحمي الوظائف المنسقة لجميع أعضاء العين سطح العين من غزو مسببات الأمراض أو الإصابة وتدعم الرؤية الواضحة تماما دون أي ألم أو إزعاج.
في سطح العين الصحي ، يزيل التفريغ المتدفق للعين أو رووم العين الغبار والخلايا الظهارية الميتة والبكتيريا والمخاط والخلايا المناعية. تقوم مصائد العدلات المجمعة خارج الخلية (aggNETs) بصياغة مصفوفة تشبه الشبكة تتكون من الكروماتين خارج الخلية ودمج هذه المكونات في رويم العين. تعمل AggNETs على حل الالتهاب عن طريق التحلل البروتيني للسيتوكينات والكيموكيناتالمؤيدة للالتهابات 4. ومع ذلك ، عندما تصبح مختلة وظيفيا ، فإن هذه الشبكات الشاذة تدفع التسبب في أمراض مثل انسداد الأوعية الدموية في COVID-195 ، وحصى المرارة6 ، و sialolithiasis7. وبالمثل ، تلعب aggNETs على سطح العين دورا وقائيا وتساهم في حل التهاب السطح شديد التعرض8. يمكن أن يؤدي التكوين المبالغ فيه أو نقص aggNETs في سطح العين إلى إضعاف استقرار الغشاء المسيل للدموع و / أو التسبب في جروح القرنية والتهاب الملتحمة ومرض جفاف العين. على سبيل المثال ، انسداد MG هو السبب الرئيسي لمرض جفاف العين9. من المعروف أيضا أن AggNETs تسد تدفق إفراز الدهون من قنوات MG وتسبب خلل في غدة Meibomian (MGD). يؤدي احتقان فتحات MG بواسطة aggNETs إلى نقص السوائل الدهنية التي تغلف سطح العين والسوائل المعبأة في زجاجات إلى الوراء ، مما يؤدي إلى خلل في وظيفة الغدة وتلف العنيب. يمكن أن يؤدي هذا الخلل الوظيفي إلى تبخر الفيلم المسيل للدموع ، وتليف الهوامش على الجفون ، والتهاب العين ، والأضرار الضارة ل MG10,11.
تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية على مر السنين لتقليد العملية المرضية ل MGD في البشر. على سبيل المثال ، ساعدت الفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين عام واحد في دراسة التأثيرات المرتبطة بالعمر على مرض جفاف العين (DED) و MGD ، مما يعكس أمراض العين في المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 50 عاما وما فوق12،13،14. علاوة على ذلك ، الأرانب هي نماذج مناسبة للتحقيق في آثار التدخلات الدوائية. لذلك ، تم الإبلاغ عن تحفيز MGD في الأرانب إما عن طريق الإدارة الموضعية للإبينفرين أو الإدخال الجهازي لحمض الريتينويك 13-cis-retinoic (isotretinoin)15،16،17،18،19.
على الرغم من أن هذه النماذج الحيوانية كانت كافية لتحديد العوامل المختلفة التي تساهم في الفيزيولوجيا المرضية ل MGD ، إلا أنها كانت مقيدة في استخدامها. على سبيل المثال ، كان نموذج الفئران ل MGD المرتبط بالعمر مثاليا لفك رموز العناصر لدى كبار السن فقط ، وبالتالي ، يبدو أن الأرانب هي النموذج الحيواني الأنسب لدراسة أمراض سطح العين ، لأنها تمكن من التحقيق في آليات فسيولوجية مرضية متعددة. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود أدوات تحليلية شاملة للكشف عن البروتينات على سطح العين ولأن أجزاء كثيرة من جينوم الأرانب غير مشروحة ، فهي محدودة للتحقيقات20,21.
بالإضافة إلى ذلك ، لم تقدم هذه النماذج الحيوانية المستخدمة للتحقيق في التسبب في مرض جفاف العين تفاصيل كافية لتحليل الذراع المناعي للاضطراب الذي يحرض على التهاب سطح العين. وفقا لذلك ، أظهر نموذج الفئران من MGD الذي طوره Reyes et al. وجود ارتباط بين مرض حساسية العين في الفئران و MGD في البشر وسلط الضوء على المسببات المناعية المسؤولة عن MGD21 الانسدادي. يربط هذا النموذج مرض العين التحسسي باستجابة TH17 التي تجند العدلات إلى الملتحمة والجفن ، مما يسبب MGD والتهاب العين المزمن21. يعد تحريض MGD والتهاب العين في نموذج الفئران هذا أداة قيمة للتحقيق في أحداث المنبع أثناء تطور الالتهاب الموضعي المدفوع باستجابة مناعية مستمرة21. يصف البروتوكول الحالي التهاب سطح العين المصحوب ب MGD الانسدادي. في هذه الطريقة ، يتم تحصين الفئران ، وبعد 2 أسابيع ، يتم تحديها على سطح العين مع المناعة لمدة 7 أيام. علاوة على ذلك ، يتم وصف خطوات عزل إفرازات العين وأعضاء العين المرتبطة بها أثناء الالتهاب الحاد وتشريح القرنية والملتحمة والجفون.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإفراز الدهني لغدد ميبوميان له أهمية كبيرة للعين السليمة22. ومع ذلك ، فإن انسداد هذه الغدد الدهنية بواسطة مصائد العدلات المجمعة خارج الخلية (aggNETs) التي تصطف كخيوط متوازية تقع على الصفائح الرصغية لكلا الجفنين يمكن أن يعطل الفيلم المسيل للدموع23. يؤدي هذا الاضطراب إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3 ؛ SCHA 2040 / 1-1 ؛ MU 4240 / 2-1 ؛ CRC1181 (C03) ؛ TRR241 (B04) ، H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878 ، وبواسطة Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) إلى MH.
Materials
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al. Age-related changes in the meibomian gland. Experimental Eye Research. 89 (6), 1021-1027 (2009).
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters – New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
