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Abstract
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Immunology and Infection

眼表面炎症の誘導と関与組織の収集

Published: August 04, 2022
doi:
10.3791/63890
, , , , , ,
1Department of Internal Medicine 3-Rheumatology and Immunology,Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen, 2Deutsches Zentrum für Immuntherapie,Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen

Summary

眼表面の炎症は眼の表面組織に害を及ぼし、眼の重要な機能を損ないます。本プロトコルは、マイボーム腺機能不全(MGD)のマウスモデルにおいて眼の炎症を誘発し、損なわれた組織を収集する方法を記載する。

Abstract

眼表面疾患には、角膜、結膜、および関連する眼表面腺ネットワークの機能と構造を乱すさまざまな障害が含まれます。マイボーム腺(MG)は、涙液膜の水性部分の蒸発を防ぐ被覆層を作成する脂質を分泌します。好中球と細胞外DNAトラップは、アレルギー性眼疾患のマウスモデルでMGと眼の表面に生息しています。凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)は、MG出口を閉塞し、MG機能障害を条件付ける細胞外クロマチンで構成されるメッシュ状のマトリックスを定式化します。ここでは、眼表面炎症およびMG機能障害を誘発する方法が提示される。角膜、結膜、まぶたなど、眼の表面に関連する臓器を採取する手順が詳細に説明されています。各臓器を処理するための確立された技術を使用して、MG機能障害の主要な形態学的および組織病理学的特徴も示されます。眼の滲出液は、眼の表面の炎症状態を評価する機会を提供します。これらの手順により、前臨床レベルでの局所および全身の抗炎症介入の調査が可能になります。

Introduction

瞬きするたびに、角膜上に分散した滑らかな涙液膜が補充されます。眼表面上皮は、眼表面上の涙液膜の分布および正しい配向を促進する。ムチンは角膜と結膜の上皮細胞によって提供され、涙腺から来る涙液膜の水性部分を目の表面に配置するのに役立ちます。最後に、MGは、涙液膜1、2、3の水性部分の蒸発を防ぐ被覆層を作成する脂質を分泌する。このように、すべての眼器官の協調機能は、侵入する病原体や怪我から眼の表面を保護し、痛みや不快感なしに透き通った視力をサポートします。

健康な眼の表面では、眼を流れる分泌物または眼のリウマチがほこり、死んだ上皮細胞、細菌、粘液、および免疫細胞を一掃します。凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)は、細胞外クロマチンで構成されるメッシュ状のマトリックスを定式化し、これらの成分を眼のリウマチに取り込みます。AggNETは、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインのタンパク質分解によって炎症を解消します4。しかし、それらが機能不全になると、これらの異常なアグネットは、COVID-195、胆石6、および唾液分泌症7の血管閉塞などの疾患の病因を引き起こします。同様に、眼表面のアグネットは保護的な役割を果たし、露出度の高い表面の炎症の解消に貢献します8。眼の表面に誇張された形成またはアグネットの欠如のいずれかが、涙液膜の安定性を損なうか、角膜創傷、瘢痕性結膜炎、およびドライアイ疾患を引き起こす可能性があります。例えば、MGの閉塞はドライアイ疾患の主な原因である9。AggNETは、MGの管からの脂質分泌の流れを塞ぎ、マイボーム腺機能障害(MGD)を引き起こすことも知られています。aggNETによるMG開口部の鬱血は、眼の表面を包む脂肪液と逆行性の瓶詰め液の不足を引き起こし、腺機能の機能不全と腺房損傷を引き起こします。この機能不全は、涙液膜の蒸発、まぶたの縁の線維化、眼の炎症、およびMG10,11への有害な損傷を引き起こす可能性があります。

ヒトにおけるMGDの病理学的過程を模倣するために、いくつかの動物モデルが長年にわたって開発されてきた。例えば、1歳のC57BL/6マウスは、50歳以上の患者の眼疾患の病理を反映して、ドライアイ疾患(DED)およびMGDに対する加齢に伴う影響の研究に役立っています12,13,14。さらに、ウサギは薬理学的介入の効果を調査するための適切なモデルである。したがって、ウサギにおけるMGDの誘導は、エピネフリンの局所投与または13-シス-レチノイン酸(イソトレチノイン)の全身導入のいずれかによって報告されています15,16,17,18,19。.

これらの動物モデルは、MGDの病態生理に寄与するさまざまな要因を決定するのに十分でしたが、その利用には制限がありました。例えば、加齢性MGDのマウスモデルは、高齢者のみの要素を解読するのに理想的であり、したがって、ウサギは複数の病態生理学的メカニズムの調査を可能にするため、眼の表面疾患を研究するのに最も適した動物モデルであると考えられました。しかし、眼の表面でタンパク質を検出するための包括的な分析ツールがなく、ウサギゲノムの多くの部分が注釈されていないため、調査には制限されています20,21。

さらに、ドライアイ疾患の病因を調査するために使用されたこれらの動物モデルは、眼表面の炎症を引き起こす障害の免疫学的アームを分析するための適切な詳細を提供しなかった。したがって、Ryesらによって開発されたMGDのマウスモデルは、マウスのアレルギー性眼疾患とヒトのMGDとの関連を示し、閉塞性MGD21の原因となる免疫病因を強調しました。このモデルは、アレルギー性眼疾患を、結膜とまぶたに好中球を動員し、MGDと慢性眼の炎症を引き起こすTH17応答に関連付けます21。このマウスモデルにおけるMGDおよび眼の炎症の誘導は、進行中の免疫応答によって引き起こされる局所炎症の発生中の上流のイベントを調査するための貴重なツールです21。現在のプロトコルは、閉塞性MGDを伴う眼表面の炎症について説明しています。この方法では、マウスを免疫し、2週間後、免疫原を用いて眼の表面に7日間挑戦する。さらに、急性炎症および角膜、結膜、および眼瞼の解剖中に眼の滲出液および関連する眼器官を単離する手順が記載されている。

Protocol

動物を含むすべての手順は、動物福祉に関する制度的ガイドラインに従って実施され、フリードリヒアレクサンダー大学エアランゲンニュルンベルク(FAU)の動物福祉委員会によって承認されました(許可番号:55.2.2-2532-2-1217)。本研究では、7〜9週齢の雌C57Bl / 6マウスを使用しました。マウスは市販の供給源( 材料表を参照)から入手し、12時間の昼/夜サイクルで特定の病原体のない状?…

Representative Results

本プロトコルは、眼表面炎症のマウスモデルを確立するための逐次ステップを記載する。プロトコルは、治療法を局所的に適用し、眼の滲出液を取得し、健康なまぶたや炎症を起こしたまぶた(図2)、角膜、結膜などの関連する付属器官を切除する方法を示すことを目的としています。結膜の単離のために上まぶたを解剖するときは注意を払い、角膜の解剖中に1x PBSに保?…

Discussion

マイボーム腺の油性分泌は、健康な目にとって非常に重要です22。しかしながら、両眼瞼の足根板上に位置する平行鎖として並ぶ凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)によるこれらの皮脂腺の閉塞は、涙液膜23を破壊する可能性がある。この破壊は、マイボーム腺機能障害(MGD)1 と涙液の蒸発の加速をもたらし、眼の表面2の損?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、ドイツ研究財団(DFG)2886 PANDORAプロジェクト-No.B3によって部分的にサポートされました。SCHA 2040/1-1;MU 4240/2-1;CRC1181(C03);TRR241(B04)、H2020-FETOPEN-2018-2020プロジェクト861878、およびフォルクスワーゲン財団(助成金97744)からMHへ。

Materials

1x PBS Gibco
Aluminium Hydroxide Imject alum Adjuvant 77161 40 mg/ mL
Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks Charles River Laboratories 
Calcium Carl roth CN93.1 1 M
Final Concentration: 5 mM
Curved forceps FST by Dumont SWITZERLAND 5/45 11251-35
Fine sharp scissor FST Stainless steel, Germany 15001-08
Laminar safety cabinet Herasafe
Macrophotography Camera Canon EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter) Nikon D5300
Mnase New England biolabs M0247S 2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) Biolegend CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline) B.Braun
Ovalbumin (OVA) Endofit, Invivogen 9006-59-1 10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin  ThermoFisher Scientific  PHZ1174 50 µg/ 500 µL in saline
Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish Greiner bio-one 628160
Scalpel Feather disposable scalpel No. 21  Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope Zaiss Stemi508
Syringe (corneal/iris washing) BD Microlane 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization) BD Microlane 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm
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References

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Singh, J., Shan, X., Mahajan, A., Herrmann, M., Schauer, C., Knopf, J., Muñoz, L. E. Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues. J. Vis. Exp. (186), e63890, doi:10.3791/63890 (2022).
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