Indução da inflamação da superfície ocular e coleta de tecidos envolvidos
Summary
A inflamação da superfície ocular prejudica os tecidos da superfície ocular e compromete as funções vitais do olho. O presente protocolo descreve um método para induzir inflamação ocular e coletar tecidos comprometidos em um modelo de camundongo de disfunção da glândula de Meibomian (MGD).
Abstract
As doenças da superfície ocular incluem uma série de distúrbios que perturbam as funções e estruturas da córnea, da conjuntiva e da rede de glândulas da superfície ocular associada. As glândulas meibomianas (MG) secretam lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal. Neutrófilos e armadilhas de DNA extracelular povoam MG e a superfície ocular em um modelo de rato de doença ocular alérgica. As armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular que oclui as saídas de MG e condiciona a disfunção de MG. Aqui, um método para induzir inflamação da superfície ocular e disfunção da MG é apresentado. Os procedimentos para a coleta de órgãos relacionados à superfície ocular, como córnea, conjuntiva e pálpebras, são descritos em detalhes. Usando técnicas estabelecidas para o processamento de cada órgão, as principais características morfológicas e histopatológicas da disfunção da MG também são mostradas. Os exsudatos oculares oferecem a oportunidade de avaliar o estado inflamatório da superfície ocular. Esses procedimentos possibilitam a investigação de intervenções anti-inflamatórias tópicas e sistêmicas em nível pré-clínico.
Introduction
Cada piscar de olhos reabastece o filme lacrimal liso disperso sobre a córnea. Os epitélios da superfície ocular facilitam a distribuição e a orientação correta do filme lacrimal na superfície ocular. As mucinas são fornecidas pelas células epiteliais da córnea e da conjuntiva para ajudar a posicionar a parte aquosa do filme lacrimal proveniente das glândulas lacrimais na superfície dos olhos. Finalmente, a MG secreta lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal 1,2,3. Desta forma, as funções coordenadas de todos os órgãos oculares protegem a superfície ocular de patógenos invasores ou lesões e suportam a visão cristalina sem qualquer dor ou desconforto.
Em uma superfície ocular saudável, a descarga ocular que flui ou o reum ocular varre a poeira, as células epiteliais mortas, as bactérias, o muco e as células imunes. Armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular e incorporam esses componentes no reum ocular. Os AggNETs resolvem a inflamação pela degradação proteolítica de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas4. No entanto, quando se tornam disfuncionais, esses aggNETs aberrantes impulsionam a patogênese de doenças como oclusões vasculares na COVID-195, cálculos biliares6 e sialolitíase7. Da mesma forma, os aggNETs na superfície ocular desempenham um papel protetor e contribuem para a resolução da inflamação da superfície altamente exposta8. Uma formação exagerada ou a falta de aggNETs na superfície ocular pode prejudicar a estabilidade do filme lacrimal e/ou causar feridas na córnea, conjuntivite cicatrizante e doença do olho seco. Por exemplo, a obstrução da MG é uma das principais causas de doença do olho seco9. AggNETs também são conhecidos por obstruir o fluxo de secreção lipídica dos ductos de MG e causar disfunção da glândula meibomiana (MGD). A congestão dos orifícios de MG por aggNETs causa falta de fluido gorduroso envolvendo a superfície ocular e fluido engarrafado retrógrado, resultando em disfunção da função da glândula e danos acinares. Essa disfunção pode resultar em evaporação do filme lacrimal, fibrose das margens das pálpebras, inflamação ocular e dano prejudicial à MG10,11.
Vários modelos animais foram desenvolvidos ao longo dos anos para imitar o processo patológico da MGD em humanos. Por exemplo, camundongos C57BL/6 com 1 ano de idade ajudaram a estudar os efeitos relacionados à idade na doença do olho seco (DED) e MGD, refletindo a patologia da doença ocular em pacientes com 50 anos ou mais12,13,14. Além disso, os coelhos são modelos apropriados para investigar os efeitos das intervenções farmacológicas. Portanto, a indução de MGD em coelhos tem sido relatada pela administração tópica de epinefrina ou pela introdução sistêmica de ácido 13-cis-retinóico (isotretinoína)15,16,17,18,19.
Embora esses modelos animais fossem adequados para determinar os diferentes fatores que contribuem para a fisiopatologia da MGD, eles foram restritos em sua utilização. Por exemplo, o modelo murino de MGD relacionada à idade foi ideal para decifrar elementos apenas em adultos mais velhos e, portanto, os coelhos pareceram ser o modelo animal mais adequado para estudar doenças da superfície ocular, pois permitem a investigação de múltiplos mecanismos fisiopatológicos. No entanto, devido à falta de ferramentas analíticas abrangentes para detectar proteínas na superfície ocular e porque muitas partes do genoma do coelho não são anotadas, elas são limitadas para investigações20,21.
Além disso, esses modelos animais utilizados para investigar a patogênese da doença do olho seco não forneceram detalhes adequados para analisar o braço imunológico do distúrbio que instiga a inflamação da superfície ocular. Nesse sentido, o modelo murino de MGD desenvolvido por Reyes et al. mostrou associação entre doença ocular alérgica em camundongos e MGD em humanos e destacou a etiologia imunológica responsável pela MGD obstrutiva21. Esse modelo associa a doença alérgica ocular a uma resposta TH17 que recruta neutrófilos para a conjuntiva e pálpebra, causando MGD e inflamação ocular crônica21. A indução de MGD e inflamação ocular neste modelo murino é uma ferramenta valiosa para investigar eventos a montante durante o desenvolvimento de inflamação local impulsionada por uma resposta imune contínua21. O protocolo atual descreve a inflamação da superfície ocular acompanhada de MGD obstrutiva. Neste método, os ratos são imunizados e, após 2 semanas, desafiados na superfície ocular com o imunógeno por 7 dias. Além disso, os passos para isolar o exsudato ocular e os órgãos oculares associados durante a inflamação aguda e a dissecção da córnea, conjuntiva e pálpebras são descritos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A secreção oleosa das glândulas meibomianas é de grande importância para um olho saudável22. No entanto, a obstrução dessas glândulas sebáceas por armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) que se alinham como filamentos paralelos localizados nas placas tarsais de ambas as pálpebras pode interromper o filme lacrimal23. Essa ruptura resulta em disfunção da glândula de Meibomian (MGD)1 e evaporação acelerada da lágri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), Projeto H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, e pela Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) à MH.
Materials
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
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