Inflammation i ögonytan skadar ögonytans vävnader och äventyrar ögats vitala funktioner. Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att inducera okulär inflammation och samla komprometterade vävnader i en musmodell av Meibomian körteldysfunktion (MGD).
Okulära ytsjukdomar inkluderar en rad störningar som stör funktionerna och strukturerna i hornhinnan, konjunktiva och det tillhörande okulära ytkörtelnätverket. Meibomiska körtlar (MG) utsöndrar lipider som skapar ett täckskikt som förhindrar avdunstning av den vattenhaltiga delen av tårfilmen. Neutrofiler och extracellulära DNA-fällor fyller MG och ögonytan i en musmodell av allergisk ögonsjukdom. Aggregerade neutrofila extracellulära fällor (aggNETs) formulerar en nätliknande matris bestående av extracellulärt kromatin som täcker MG-utlopp och villkorar MG-dysfunktion. Här presenteras en metod för att inducera okulär ytinflammation och MG-dysfunktion. Förfarandena för att samla organ relaterade till ögonytan, såsom hornhinnan, konjunktiva och ögonlocken, beskrivs i detalj. Med hjälp av etablerade tekniker för bearbetning av varje organ visas också de viktigaste morfologiska och histopatologiska egenskaperna hos MG-dysfunktion. Okulära exsudater erbjuder möjlighet att bedöma det inflammatoriska tillståndet hos den okulära ytan. Dessa förfaranden möjliggör undersökning av aktuella och systemiska antiinflammatoriska ingrepp på preklinisk nivå.
Varje ögonblick fyller på den släta tårfilmen som sprids över hornhinnan. Det okulära ytepitelet underlättar fördelningen och korrekt orientering av tårfilmen på ögonytan. Muciner tillhandahålls av hornhinnan och konjunktiva epitelceller för att hjälpa till att placera den vattenhaltiga delen av tårfilmen som kommer från lacrimalkörtlarna på ögonens yta. Slutligen utsöndrar MG lipider som skapar ett täckskikt som förhindrar avdunstning av den vattenhaltiga delen av tårfilmen 1,2,3. På detta sätt skyddar de samordnade funktionerna hos alla ögonorgan den okulära ytan från invaderande patogener eller skador och stöder kristallklar syn utan smärta eller obehag.
I en frisk okulär yta sveper den okulära flytande urladdningen eller ögonreumet bort damm, döda epitelceller, bakterier, slem och immunceller. Aggregerade neutrofila extracellulära fällor (aggNETs) formulerar en nätliknande matris bestående av extracellulärt kromatin och införlivar dessa komponenter i ögonreumet. AggNETs löser inflammation genom proteolytisk nedbrytning av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner4. Men när de blir dysfunktionella driver dessa avvikande aggNETs patogenesen av sjukdomar som vaskulära ocklusioner i COVID-195, gallsten6 och sialolithiasis7. På samma sätt spelar aggNET på den okulära ytan en skyddande roll och bidrar till att lösa inflammation i den högexponerade ytan8. Antingen en överdriven bildning eller brist på aggNET i ögonytan kan försämra tårfilmens stabilitet och / eller orsaka hornhinnesår, cikatriserande konjunktivit och torra ögonsjukdomar. Till exempel är obstruktionen av MG en ledande orsak till torra ögonsjukdomar9. AggNETs är också kända för att ansluta flödet av lipidsekretion från kanalerna i MG och orsaka Meibomian körtel dysfunktion (MGD). Överbelastningen av MG-öppningar av aggNETs orsakar brist på fettvätska som omsluter den okulära ytan och retrograd flaskvätska, vilket resulterar i dysfunktion i körtelfunktionen och acinarskador. Denna dysfunktion kan resultera i tårfilmsavdunstning, fibros av marginalerna på ögonlocken, ögoninflammation och skadlig skada på MG10,11.
Flera djurmodeller har utvecklats genom åren för att imitera den patologiska processen med MGD hos människor. Till exempel har C57BL/6-möss i åldern 1 år hjälpt till att studera åldersrelaterade effekter på torra ögonsjukdomar (DED) och MGD, vilket återspeglar ögonsjukdomspatologin hos patienter i åldern 50 år och äldre12,13,14. Dessutom är kaniner lämpliga modeller för att undersöka effekterna av farmakologiska ingrepp. Därför har inducerande MGD hos kaniner rapporterats genom antingen topisk administrering av adrenalin eller systemisk introduktion av 13-cis-retinsyra (isotretinoin)15,16,17,18,19.
Även om dessa djurmodeller var tillräckliga för att bestämma de olika faktorer som bidrog till patofysiologin hos MGD, var de begränsade i deras användning. Till exempel var murinmodellen av åldersrelaterad MGD idealisk för att dechiffrera element endast hos äldre vuxna, och därför verkade kaniner vara den mest lämpliga djurmodellen för att studera okulära ytsjukdomar, eftersom de möjliggör undersökning av flera patofysiologiska mekanismer. På grund av bristen på omfattande analysverktyg för att detektera proteiner vid ögonytan och eftersom många delar av kaningenomet är oannoterade är de dock begränsade för undersökningar20,21.
Dessutom gav dessa djurmodeller som användes för att undersöka patogenesen av torra ögonsjukdomar inte tillräckliga detaljer för att analysera den immunologiska armen av sjukdomen som initierar inflammation i ögonytan. Följaktligen visade den murina modellen av MGD som utvecklats av Reyes et al. ett samband mellan allergisk ögonsjukdom hos möss och MGD hos människor och lyfte fram immunetiologin som är ansvarig för obstruktiv MGD21. Denna modell associerar allergisk ögonsjukdom med ett TH17-svar som rekryterar neutrofiler till konjunktiva och ögonlock, vilket orsakar MGD och kronisk okulär inflammation21. Induktionen av MGD och okulär inflammation i denna murina modell är ett värdefullt verktyg för att undersöka uppströms händelser under utvecklingen av lokal inflammation som drivs av ett pågående immunsvar21. Det nuvarande protokollet beskriver ögonytans inflammation åtföljd av obstruktiv MGD. I denna metod immuniseras möss och utmanas efter 2 veckor på ögonytan med immunogenet i 7 dagar. Vidare beskrivs stegen för att isolera okulärt exsudat och de associerade okulära organen under akut inflammation och dissektion av hornhinnan, konjunktiva och ögonlocken.
Den oljiga utsöndringen av de meibomiska körtlarna är av stor betydelse för ett friskt öga22. Obstruktionen av dessa talgkörtlar av aggregerade neutrofila extracellulära fällor (aggNETs) som stämmer upp som parallella strängar som ligger på tarsalplattorna i båda ögonlocken kan emellertid störa tårfilmen23. Denna störning resulterar i Meibomian körtel dysfunktion (MGD)1 och accelererad tåravdunstning och villkorar skadan på ögonyt…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, och av Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) till MH.
1x PBS | Gibco | ||
Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |