基于磁性纳米颗粒免疫分析的交错限制微流控亚克力装置的计算机数控微铣削
Summary
微流体是开发诊断测试的强大工具。然而，通常需要昂贵的设备和材料，以及费力的制造和处理技术。在这里，我们详细介绍了在低成本和易于使用的环境中用于磁性微粒和纳米颗粒免疫测定的丙烯酸微流体装置的制造方案。
Abstract
微流体系统极大地改进了免疫测定技术。然而，许多微细加工技术需要专门、昂贵或复杂的设备，这使得制造成本高昂且与大规模生产不兼容，这是在资源匮乏的环境中采用即时检测 （POCT） 的最重要先决条件之一。这项工作描述了使用计算机数控（CNC）微铣削技术进行纳米颗粒偶联酶免疫测定测试的丙烯酸（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）装置的制造过程。微流体装置的功能通过执行免疫测定来显示，以使用溶菌酶作为偶联到100nm磁性纳米颗粒的模型抗原来检测商业抗体。该设备集成了高度仅为 5 μm 的物理交错限制，用于通过放置外部磁铁来捕获构成磁阱的磁性微粒。这样，共轭纳米颗粒免疫载体上的磁力足以捕获它们并抵抗流动阻力。这种微流体装置特别适用于低成本的大规模生产，而不会损失免疫测定性能的精度。
Introduction
近年来，微流体在免疫测定技术中发挥了重要作用1。与传统免疫分析相比，小型化技术具有许多突出的优势，例如减少样品和试剂消耗、缩短孵育时间、高效的溶液交换以及更高的集成度和自动化程度2。
此外，免疫测定中的微流体系统与磁性纳米颗粒作为免疫支持物相结合，大大减少了孵育时间，由于增加了表面体积比3，实现了高检测灵敏度。颗粒的布朗运动改善了抗原-抗体复合物4，5形成过程中的反应动力学。此外，纳米颗粒的磁性提供了集成到不同微流体器件配置中的多功能性，使其成为小型化片上生物传感系统中信号传导和分子捕获的理想候选者5。然而，由于高表面体积比6，磁力明显弱于纳米尺度的阻力。因此，捕获纳米颗粒用于关键的免疫测定步骤（如洗涤和检测）可能具有挑战性，而传统的磁铁是不够的4.
操纵纳米颗粒的一种有效方法是使用由铁微粒形成的微流体磁阱，铁微粒包装在微流体结构3中。因此，当外部磁铁接近时，在磁化多孔介质内，磁力和磁通力之间会产生复杂的相互作用。作用在纳米颗粒上的磁力足够强，可以捕获它们并抵抗流动阻力3，4，7。这种方法需要微细加工技术，达到几微米量级的分辨率，以产生保留微粒的微度量结构。
目前的微细加工技术允许高分辨率制造从几微米到数百纳米的结构8。然而，其中许多技术需要专门的、昂贵的或复杂的设备。主要困难之一是需要用于模具制造的洁净室，这仍然昂贵且耗时8，9。最近，微流体工程师通过开发各种替代制造方法克服了这一缺点，这些方法具有降低成本、缩短周转时间、更便宜的材料和工具以及增加的功能等各种优势8。通过这种方式，新的微细加工技术的发展带来了低成本、非洁净室的方法，其分辨率低至 10 μm8。图案可以直接在基板上使用，而不会产生昂贵的成型图案，从而避免了耗时的过程。直接制造方法包括CNC铣削，激光烧蚀和直接光刻8。所有这些方法都适用于在各种材料中生产高纵横比通道，无论其硬度如何9，从而在微流体装置中实现新的有利几何形状，物理行为和质量8。
CNC微铣削使用从基板上去除块状材料的切削工具创建微尺度结构，是微流体装置的有效制造方法10，11。微铣削技术可用于微流体应用，可直接在工作表面上创建微通道和特征，具有关键优势：可以在短时间内（不到 30 分钟）制造工件，从而显着缩短从设计到原型的周转时间12.此外，不同材料、尺寸和形状的切割配件的广泛可用性使数控铣床成为一种合适的工具，可以在多种类型的低成本一次性材料中制造不同的功能13。
在微铣削中常用的所有材料中，热塑性塑料由于其许多有利的性能和与生物应用的兼容性而仍然是首选10，14。热塑性塑料是微流体系统的一种有吸引力的基材，因为它们在开发低成本、一次性分析系统方面具有显著优势9.此外，这些材料非常适合大批量制造工艺，使其适合商业化和大规模生产。由于这些原因，自微流体10早期以来，PMMA等热塑性塑料一直被认为是可靠和坚固的材料。已经描述了不同的协议来制造热塑性塑料中的闭合通道，例如溶剂键合15，热键合16和紫外线（UV）/臭氧表面处理粘合17。
在许多情况下，对于某些需要小于10μm结构的微流体应用，使用传统微铣床实现的定位分辨率是不够的。高端微铣具有足够的分辨率。不幸的是，由于价格高昂，它的使用仅限于少数用户12。此前，我们的研究小组报告了一种低成本刀具的制造和操纵，该刀具允许加工小于10μm的结构，克服了传统铣床的分辨率12。该夹具是通过3D打印制造的具有简单电子设备的平台，包含三个压电致动器。表面包含铰链形接头，当压电元件同时作用时，可以将其抬起。Z轴位移可以控制在500nm的分辨率和±1.5μm12的精度下。
本文介绍了通过微铣削技术制造丙烯酸设备（PMMA）的过程步骤。芯片设计由一个宽 200 μm 、高 200 μm 的主通道和一个相同尺寸的侧通道组成，用于吹扫试剂的流动。在中心区域，通道被高度仅为5μm的物理限制中断，该限制由该组12制造的3D打印压电平台制造，以捕获构成纳米颗粒磁性陷阱的磁性微粒通过放置外部磁铁。我们通过执行免疫测定来显示微流体装置的操作，以使用溶菌酶作为偶联到100nm磁性纳米颗粒的模型抗原来检测商业抗体。该设备结合了使其独特的不同功能4：使用磁性纳米颗粒作为免疫支持将总测试时间从几小时减少到几分钟;使用荧光酶进行检测可实现与标准酶联免疫吸附测定（ELISA）相当的检测限;并且使用热塑性塑料作为制造材料使其与大规模生产兼容，这是以前的微流体纳米颗粒的磁性陷阱3所没有的，并使其成为开发POCT的绝佳候选者。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用微铣削技术制备了一种使用纳米颗粒作为免疫载体的用于免疫测定的丙烯酸微流体装置。在基材上直接制造的方法具有避免使用母模以及这意味着时间和成本的优点。但是，它仅限于快速原型制作和大批量设备制造。
在这里，我们使用了先前报道的铣床12的附件压电平台。该平台通过3D打印制造，以创建垂直分辨率优于传统微铣床10μm分辨率的可变深度?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了墨西哥国家委员会（CONACYT）在“科学、技术和创新活动方案”的赠款312231支持，以及AMEXCID和墨西哥外交部（SRE）在“SARS-CoV-2的Prueba serológica rápida、barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”的赠款下。JAHO感谢Conacyt Mexico的博士奖学金。
Materials
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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