Microfresatura a controllo numerico computerizzato di un dispositivo acrilico microfluidico con restrizione sfalsata per saggi immunologici magnetici basati su nanoparticelle

Summary

La microfluidica è un potente strumento per lo sviluppo di test diagnostici. Tuttavia, sono spesso necessarie attrezzature e materiali costosi, nonché laboriose tecniche di fabbricazione e manipolazione. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo di fabbricazione di un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici magnetici basati su micro e nanoparticelle in un ambiente a basso costo e semplice da usare.

Abstract

I sistemi microfluidici hanno notevolmente migliorato le tecniche di dosaggio immunologico. Tuttavia, molte tecniche di microfabbricazione richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate, rendendo la fabbricazione costosa e incompatibile con la produzione di massa, che è una delle precondizioni più importanti per l’adozione di test point-of-care (POCT) in ambienti con risorse limitate. Questo lavoro descrive il processo di fabbricazione di un dispositivo acrilico (polimetilmetacrilato, PMMA) per test immunologici enzimatici coniugati con nanoparticelle utilizzando la tecnica di microfresatura a controllo numerico computerizzato (CNC). Il funzionamento del dispositivo microfluidico è dimostrato eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo integra una restrizione fisica sfalsata di soli 5 μm di altezza, utilizzata per catturare le microparticelle magnetiche che compongono una trappola magnetica posizionando un magnete esterno. In questo modo, la forza magnetica sul supporto immunologico delle nanoparticelle coniugate è sufficiente per catturarle e resistere alla resistenza del flusso. Questo dispositivo microfluidico è particolarmente adatto per la produzione di massa a basso costo senza perdita di precisione per le prestazioni del dosaggio immunologico.

Introduction

Negli ultimi anni, la microfluidica ha svolto un ruolo importante nelle tecniche di dosaggio immunologico¹. La tecnologia di miniaturizzazione presenta molti vantaggi eccezionali rispetto ai test immunologici tradizionali, come il ridotto consumo di campioni e reagenti, tempi di incubazione più brevi, uno scambio efficiente di soluzioni e una maggiore integrazione e automazione².

Inoltre, i sistemi microfluidici nei saggi immunologici, in associazione con nanoparticelle magnetiche come immunosupporto, riducono considerevolmente i tempi di incubazione, raggiungendo un’elevata sensibilità di rivelazione grazie all’aumento del rapporto superficie-volume³. Il movimento browniano delle particelle migliora la cinetica di reazione durante la formazione del complesso antigene-anticorpo ^4,5. Inoltre, le proprietà magnetiche delle nanoparticelle forniscono la versatilità per essere integrate in diverse configurazioni di dispositivi microfluidici, rendendole un candidato ideale per la segnalazione e la cattura di molecole in sistemi di biorilevamento miniaturizzati su chip⁵. Tuttavia, le forze magnetiche sono significativamente più deboli delle forze di trascinamento su scala nanometrica a causa dell’elevato rapporto superficie-volume⁶. Pertanto, la cattura di nanoparticelle per fasi cruciali del dosaggio immunologico come il lavaggio e il rilevamento può essere difficile e un magnete convenzionale è insufficiente⁴.

Un modo efficace per manipolare le nanoparticelle è l’uso di una trappola magnetica microfluidica formata da microparticelle di ferro, che sono impacchettate in una struttura microfluidica³. Pertanto, quando un magnete esterno si avvicina, viene creata un’interazione complessa all’interno del mezzo poroso magnetizzato tra le forze magnetiche e di flusso. La forza magnetica che agisce sulle nanoparticelle è abbastanza forte da catturarle e resistere alla resistenza del flusso ^3,4,7. Questo approccio richiede tecniche di microfabbricazione che raggiungano risoluzioni dell’ordine di pochi micrometri per generare strutture micrometriche che trattengano le microparticelle.

Le attuali tecniche di microfabbricazione consentono la fabbricazione ad alta risoluzione di strutture da pochi micron a centinaia di nanometri⁸. Tuttavia, molte di queste tecniche richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate. Una delle principali difficoltà è la necessità di una camera bianca per la fabbricazione di stampi, che rimane costosa e dispendiosa in termini di tempo ^8,9. Recentemente, gli ingegneri microfluidici hanno superato questo inconveniente sviluppando una varietà di metodi di fabbricazione alternativi, con vari vantaggi come costi ridotti, tempi di consegna più rapidi, materiali e strumenti più economici e maggiore funzionalità⁸. In questo modo, lo sviluppo di nuove tecniche di microfabbricazione ha portato metodi a basso costo, non per camere bianche, che raggiungono risoluzioni fino a 10 μm⁸. La modellazione può essere utilizzata direttamente su un substrato senza generare un costoso modello di stampaggio, evitando così un processo dispendioso in termini di tempo. I metodi di fabbricazione diretta includono la fresatura CNC, l’ablazione laser e la litografia diretta⁸. Tutti questi metodi sono adatti per produrre canali ad alto rapporto di aspetto in una vasta gamma di materiali, indipendentemente dalla loro durezza⁹, consentendo nuove e vantaggiose geometrie, comportamenti fisici e qualità nei dispositivi microfluidici⁸.

La microfresatura CNC crea strutture su microscala utilizzando utensili da taglio che rimuovono materiale sfuso da un substrato ed è un metodo di fabbricazione efficace per dispositivi microfluidici^10,11. La tecnica di microfresatura può essere utile nelle applicazioni microfluidiche per creare microcanali e caratteristiche direttamente sul piano di lavoro, offrendo un vantaggio chiave: un pezzo può essere fabbricato in breve tempo (meno di 30 minuti), riducendo significativamente i tempi di consegna dalla progettazione al prototipo¹². Inoltre, l’ampia disponibilità di accessori da taglio di diversi materiali, dimensioni e forme rende le fresatrici CNC uno strumento adatto che ha permesso la fabbricazione di diverse caratteristiche in molti tipi di materiali usa e getta a basso costo¹³.

Tra tutti i materiali comunemente utilizzati nella microfresatura, i termoplastici rimangono una scelta leader grazie alle loro numerose proprietà favorevoli e alla compatibilità con le applicazioni biologiche^10,14. I materiali termoplastici sono un substrato interessante per i sistemi microfluidici grazie ai loro significativi vantaggi per lo sviluppo di sistemi analitici monouso a basso costo⁹. Inoltre, questi materiali sono altamente suscettibili ai processi di produzione ad alto volume, rendendoli adatti alla commercializzazione e alla produzione di massa. Per questi motivi, i materiali termoplastici come il PMMA sono stati considerati materiali affidabili e robusti fin dai primi anni della microfluidica¹⁰. Sono stati descritti diversi protocolli per fabbricare canali chiusi in materiali termoplastici, come il legame solvente¹⁵, il legame termico¹⁶ e l’incollaggio con trattamento superficiale ultravioletto (UV) / ozono¹⁷.

In molti casi, la risoluzione di posizionamento ottenuta con le microfresatrici convenzionali non è sufficiente per alcune applicazioni microfluidiche che richiedono strutture inferiori a 10 μm. La microfresatura di fascia alta ha una risoluzione sufficiente. Sfortunatamente, a causa dei prezzi elevati, il suo utilizzo è limitato a una manciata di utenti¹². In precedenza, il nostro gruppo di ricerca ha riportato la fabbricazione e la manipolazione di uno strumento a basso costo che consente di lavorare strutture inferiori a 10 μm, superando la risoluzione delle fresatrici convenzionali¹². L’apparecchio è una piattaforma prodotta dalla stampa 3D con elettronica semplice, contenente tre attuatori piezoelettrici. La superficie contiene giunti a cerniera che consentono di sollevarla quando gli elementi piezoelettrici agiscono simultaneamente. Lo spostamento dell’asse Z può essere controllato con una risoluzione di 500 nm e una precisione di ±1,5 μm¹².

Questo documento presenta le fasi del processo di produzione di un dispositivo acrilico (PMMA) attraverso una tecnica di microfresatura. Il design del chip è costituito da un canale principale largo 200 μm e alto 200 μm e da un canale laterale con le stesse dimensioni per spurgare il flusso dei reagenti. Nella regione centrale, il canale è interrotto da una restrizione fisica di soli 5 μm di altezza, fabbricata con la piattaforma piezoelettrica stampata in 3D realizzata da questo gruppo¹², per catturare le microparticelle magnetiche che costituiscono una trappola magnetica per le nanoparticelle posizionando un magnete esterno. Mostriamo il funzionamento del dispositivo microfluidico eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo combina diverse caratteristiche che lo rendono unico⁴: l’uso di nanoparticelle magnetiche come supporto immunitario riduce il tempo totale di test da ore a minuti; l’utilizzo di un enzima fluorogenico per la rilevazione consente limiti di rilevazione paragonabili a quelli dei saggi standard di immunoassorbimento enzimatico (ELISA); e l’uso di un termoplastico come materiale di fabbricazione lo rende compatibile con la produzione di massa, cosa che non era il caso delle precedenti trappole magnetiche di nanoparticelle microfluidiche³, e lo rende un ottimo candidato per sviluppare POCT.

Protocol

1. Microfresatura Rettifica superficialeAccendere la microfresatrice e il controller piezoelettrico. Avviare i rispettivi software di controllo12. Selezionare le punte di fresa richieste (diametri 200 μm e 800 μm). Posizionarli nell’apposito vano della fresatrice (Figura 1). Tagliare rettangoli di 9 mm x 25 mm di PMMA di spessore 1,3 mm con la punta da 800 μm. Attaccare con cura uno di questi rettangoli con n…

Representative Results

È stato possibile stabilire un protocollo di fabbricazione altamente riproducibile che migliora la risoluzione della tecnica di microfresatura convenzionale. Utilizzando questo protocollo, si ottiene la fabbricazione di un canale di soli 5 μm di altezza che funziona come una restrizione sfalsata in un canale alto 200 μm. Il design semplice della restrizione sfalsata cattura microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro che, una volta compattate nel microcanale, consentono la creazione di una trappola magnetica quand…

Discussion

Un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici utilizzando nanoparticelle come supporto immunologico è stato fabbricato utilizzando una tecnica di microfresatura. Il metodo di produzione diretta sul substrato ha il vantaggio di evitare l’utilizzo di uno stampo master e i tempi e i costi che questo comporta. Tuttavia, è limitato alla prototipazione rapida e alla produzione di dispositivi ad alto volume.

Qui, abbiamo utilizzato una piattaforma piezoelettrica accessoria precedente…

Materials

0.008 Endmill	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12
0.032 Endmill	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12
Carbonyl-iron microparticles	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
Chloroform	Fermont	6201	Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate
CMOS camera Moment	Teledyne Photometrics		Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood	Unknown	Unknown
Flexible Plastic Tubing	Tygon	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope	ZEISS	Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle	Loctite	98612
Homemade piezoelectric controller application	LabView		See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive	Henkel	49503	Apply with micropipette tip or dispensing needle
MagJET Separation Rack	thermoscientific		12 x 1.5 mL
Mechanic press	Home-made
Milling Machine	Roland	MDX-50
Piezoelectric platform	Home-made		See reference 12
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic	Goodfellow	ME303018/1	Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107	Image acquisition software
Stereo microscope	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Syringe pump	kd Scientific	KDS200	Can hold up to two syringes
Utrasonic bath	Branson	2800
VPanel software	Windows OS	Version 1.0.3.0	Software for controlling the micromilling machine