Microfresagem de Controle Numérico Computacional de um Dispositivo Acrílico Microfluídico com uma Restrição Escalonada para Imunoensaios Magnéticos Baseados em Nanoppartículas

Summary

A microfluídica é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de testes de diagnóstico. No entanto, equipamentos e materiais caros, bem como técnicas de fabricação e manuseio trabalhosas, são frequentemente necessários. Aqui, detalhamos o protocolo de fabricação de um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios magnéticos baseados em micro e nanopartículas em um ambiente de baixo custo e simples de usar.

Abstract

Os sistemas microfluídicos melhoraram muito as técnicas de imunoensaio. No entanto, muitas técnicas de microfabricação exigem equipamentos especializados, caros ou complicados, tornando a fabricação cara e incompatível com a produção em massa, que é uma das pré-condições mais importantes para que os testes no local de atendimento (POCT) sejam adotados em ambientes com poucos recursos. Este trabalho descreve o processo de fabricação de um dispositivo acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para teste de imunoensaio enzimático conjugado com nanopartículas utilizando a técnica de microfresagem de controle numérico computadorizado (CNC). O funcionamento do dispositivo microfluídico é demonstrado pela realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra uma restrição física escalonada de apenas 5 μm de altura, usada para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética colocando um ímã externo. Desta forma, a força magnética sobre o imunosuporte de nanopartículas conjugadas é suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto de fluxo. Este dispositivo microfluídico é particularmente adequado para produção em massa de baixo custo sem a perda de precisão para o desempenho do imunoensaio.

Introduction

Nos últimos anos, a microfluídica tem desempenhado um papel importante nas técnicas de imunoensaio¹. A tecnologia de miniaturização tem muitas vantagens notáveis em comparação com os imunoensaios tradicionais, como consumo reduzido de amostras e reagentes, tempos de incubação mais curtos, troca eficiente de soluções e maior integração e automação².

Além disso, sistemas microfluídicos em imunoensaios, em associação com nanopartículas magnéticas como imunosuporte, reduzem consideravelmente os tempos de incubação, alcançando alta sensibilidade de detecção devido ao aumento da relação superfície-volume³. O movimento browniano das partículas melhora a cinética de reação durante a formação do complexo antígeno-anticorpo ^4,5. Além disso, as propriedades magnéticas das nanopartículas proporcionam a versatilidade para serem integradas em diferentes configurações de dispositivos microfluídicos, tornando-as um candidato ideal para sinalização e captura de moléculas em sistemas de biossensoriamento miniaturizados on-chip⁵. No entanto, as forças magnéticas são significativamente mais fracas do que as forças de arrasto na escala nanométrica devido à alta relação superfície-volume⁶. Portanto, a captura de nanopartículas para etapas cruciais de imunoensaio, como lavagem e detecção, pode ser um desafio, e um ímã convencional é insuficiente⁴.

Uma maneira eficiente de manipular as nanopartículas é o uso de uma armadilha magnética microfluídica formada por micropartículas de ferro, que são embaladas em uma estrutura microfluídica³. Portanto, quando um ímã externo se aproxima, uma interação complexa é criada dentro do meio poroso magnetizado entre as forças magnéticas e de fluxo. A força magnética que atua sobre as nanopartículas é forte o suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto do fluxo ^3,4,7. Essa abordagem requer técnicas de microfabricação que atinjam resoluções da ordem de alguns micrômetros para gerar estruturas micrométricas que retenham as micropartículas.

As técnicas atuais de microfabricação permitem a fabricação de estruturas de alta resolução de alguns mícrons a centenas de nanômetros⁸. No entanto, muitas dessas técnicas exigem equipamentos especializados, caros ou complicados. Uma das principais dificuldades é a exigência de uma sala limpa para fabricação de moldes, que continua dispendiosa e ^{demorada 8,9}. Recentemente, os engenheiros microfluídicos superaram essa desvantagem desenvolvendo uma variedade de métodos alternativos de fabricação, com várias vantagens, como custos reduzidos, tempos de resposta mais rápidos, materiais e ferramentas mais baratos e maior funcionalidade⁸. Desta forma, o desenvolvimento de novas técnicas de microfabricação trouxe métodos de baixo custo, não limpos, que alcançam resoluções tão baixas quanto 10 μm⁸. A padronização pode ser usada diretamente em um substrato sem gerar um padrão de moldagem caro, evitando assim um processo demorado. Os métodos de fabricação direta incluem fresamento CNC, ablação a laser e litografia direta⁸. Todos esses métodos são adequados para a produção de canais de alta relação de aspecto em uma ampla gama de materiais, independentemente de sua dureza⁹, possibilitando novas e vantajosas geometrias, comportamentos físicos e qualidades em dispositivos microfluídicos⁸.

A microfresagem CNC cria estruturas em microescala utilizando ferramentas de corte que removem material a granel de um substrato e é um método de fabricação eficaz para dispositivos microfluídicos^10,11. A técnica de microfresagem pode ser útil em aplicações microfluídicas para criar microcanais e recursos diretamente na superfície de trabalho, oferecendo uma vantagem fundamental: uma peça de trabalho pode ser fabricada em um curto espaço de tempo (menos de 30 min), reduzindo significativamente o tempo de resposta desde o projeto até o protótipo¹². Além disso, a ampla disponibilidade de acessórios de corte de diferentes materiais, tamanhos e formas torna as fresadoras CNC uma ferramenta adequada que permitiu a fabricação de diferentes características em muitos tipos de materiais descartáveis de baixo custo¹³.

Dentre todos os materiais comumente utilizados na micromoagem, os termoplásticos continuam sendo uma escolha líder devido às suas muitas propriedades favoráveis e compatibilidade com aplicações biológicas^10,14. Os termoplásticos são um substrato atraente para sistemas microfluídicos devido às suas vantagens significativas para o desenvolvimento de sistemas analíticos descartáveis de baixo custo⁹. Além disso, esses materiais são altamente passíveis de processos de fabricação de alto volume, tornando-os adequados para comercialização e produção em massa. Por essas razões, termoplásticos como o PMMA têm sido considerados materiais confiáveis e robustos desde os primórdios da microfluídica¹⁰. Diferentes protocolos têm sido descritos para fabricar canais fechados em termoplásticos, como a ligação por solvente¹⁵, a ligação por calor¹⁶ e a ligação ultravioleta (UV)/ozônio para tratamento superficial¹⁷.

Em muitos casos, a resolução de posicionamento alcançada com microfresadoras convencionais não é suficiente para algumas aplicações microfluídicas que exigem estruturas menores que 10 μm. A microfresagem de alta qualidade tem resolução suficiente. Infelizmente, devido aos altos preços, seu uso é limitado a um punhado de usuários¹². Anteriormente, nosso grupo de pesquisa relatou a fabricação e manipulação de uma ferramenta de baixo custo que permite usinagem de estruturas inferiores a 10 μm, superando a resolução de fresadoras convencionais¹². O acessório é uma plataforma fabricada por impressão 3D com eletrônica simples, contendo três atuadores piezoelétricos. A superfície contém juntas em forma de dobradiça que permitem que ela seja levantada quando os elementos piezoelétricos agem simultaneamente. O deslocamento do eixo Z pode ser controlado com uma resolução de 500 nm e uma precisão de ±1,5 μm¹².

Este trabalho apresenta as etapas do processo de fabricação de um dispositivo acrílico (PMMA) através de uma técnica de microfresagem. O projeto do chip consiste em um canal principal de 200 μm de largura e 200 μm de altura e um canal lateral com as mesmas dimensões para purgar o fluxo dos reagentes. Na região central, o canal é interrompido por uma restrição física de apenas 5 μm de altura, fabricada com a plataforma piezoelétrica impressa em 3D feita por esse grupo¹², para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética para nanopartículas através da colocação de um ímã externo. Mostramos o funcionamento do dispositivo microfluídico através da realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que o tornam único⁴: o uso de nanopartículas magnéticas como suporte imunológico reduz o tempo total de teste de horas para minutos; a utilização de uma enzima fluorogénica para detecção permite limites de detecção comparáveis aos dos ensaios imunoenzimáticos padrão (ELISAs); e o uso de um termoplástico como material de fabricação o torna compatível com a produção em massa, o que não foi o caso das armadilhas magnéticas³ das nanopartículas microfluídicas anteriores, e o torna um excelente candidato para o desenvolvimento do POCT.

Protocol

1. Micromoagem Moagem de superfícieLigue a microfresadora e o controlador piezoelétrico. Inicie seu respectivo software de controle12. Selecione os bits finais do moinho necessários (diâmetros de 200 μm e 800 μm). Colocá-los no compartimento apropriado da fresadora (Figura 1). Corte retângulos de 9 mm x 25 mm de PMMA de 1,3 mm de espessura com o bit final do moinho de 800 μm. Anexe cuidadosamente um des…

Representative Results

Foi possível estabelecer um protocolo de fabricação altamente reprodutível que melhora a resolução da técnica de micromoagem convencional. Usando este protocolo, a fabricação de um canal tão pequeno quanto 5 μm de altura que opera como uma restrição escalonada em um canal de 200 μm de altura é alcançada. O design simples da restrição escalonada captura micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro que, quando compactadas no microcanal, permitem a criação de uma armadilha magnética quando um ímã…

Discussion

Um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios utilizando nanopartículas como imunosuporte foi fabricado utilizando uma técnica de microfresamento. O método de fabricação direta no substrato tem a vantagem de evitar o uso de um molde mestre e o tempo e os custos que isso implica. No entanto, é limitado à prototipagem rápida e fabricação de dispositivos de alto volume.

Aqui, utilizou-se uma plataforma piezoelétrica acessória previamente relatada para a fresadora<sup class…

Materials

0.008 Endmill	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12
0.032 Endmill	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12
Carbonyl-iron microparticles	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
Chloroform	Fermont	6201	Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate
CMOS camera Moment	Teledyne Photometrics		Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood	Unknown	Unknown
Flexible Plastic Tubing	Tygon	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope	ZEISS	Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle	Loctite	98612
Homemade piezoelectric controller application	LabView		See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive	Henkel	49503	Apply with micropipette tip or dispensing needle
MagJET Separation Rack	thermoscientific		12 x 1.5 mL
Mechanic press	Home-made
Milling Machine	Roland	MDX-50
Piezoelectric platform	Home-made		See reference 12
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic	Goodfellow	ME303018/1	Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107	Image acquisition software
Stereo microscope	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Syringe pump	kd Scientific	KDS200	Can hold up to two syringes
Utrasonic bath	Branson	2800
VPanel software	Windows OS	Version 1.0.3.0	Software for controlling the micromilling machine