Microfresado de control numérico computarizado de un dispositivo acrílico microfluídico con una restricción escalonada para inmunoensayos magnéticos basados en nanopartículas
Summary
La microfluídica es una poderosa herramienta para el desarrollo de pruebas diagnósticas. Sin embargo, a menudo se requieren equipos y materiales costosos, así como técnicas laboriosas de fabricación y manipulación. Aquí, detallamos el protocolo de fabricación de un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos magnéticos basados en micro y nanopartículas en un entorno de bajo costo y fácil de usar.
Abstract
Los sistemas microfluídicos han mejorado enormemente las técnicas de inmunoensayo. Sin embargo, muchas técnicas de microfabricación requieren equipos especializados, costosos o complicados, lo que hace que la fabricación sea costosa e incompatible con la producción en masa, que es una de las condiciones previas más importantes para que las pruebas en el punto de atención (POCT) se adopten en entornos de bajos recursos. Este trabajo describe el proceso de fabricación de un dispositivo de acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para pruebas de inmunoensayo enzimático conjugado con nanopartículas utilizando la técnica de microfresado de control numérico computarizado (CNC). El funcionamiento del dispositivo microfluídico se demuestra mediante la realización de un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra una restricción física escalonada de solo 5 μm de altura, utilizada para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética colocando un imán externo. De esta manera, la fuerza magnética sobre el inmunosoporte de las nanopartículas conjugadas es suficiente para capturarlas y resistir el arrastre de flujo. Este dispositivo microfluídico es particularmente adecuado para la producción en masa de bajo costo sin pérdida de precisión para el rendimiento del inmunoensayo.
Introduction
En los últimos años, la microfluídica ha desempeñado un papel importante en las técnicas de inmunoensayo1. La tecnología de miniaturización tiene muchas ventajas sobresalientes en comparación con los inmunoensayos tradicionales, como la reducción del consumo de muestras y reactivos, tiempos de incubación más cortos, intercambio eficiente de soluciones y mayor integración y automatización2.
Además, los sistemas microfluídicos en inmunoensayos, en asociación con nanopartículas magnéticas como inmunosoporte, reducen considerablemente los tiempos de incubación, logrando una alta sensibilidad de detección debido al aumento de la relación superficie-volumen3. El movimiento browniano de las partículas mejora la cinética de reacción durante la formación del complejo antígeno-anticuerpo 4,5. Además, las propiedades magnéticas de las nanopartículas proporcionan la versatilidad para ser integradas en diferentes configuraciones de dispositivos microfluídicos, lo que las convierte en un candidato ideal para la señalización y captura de moléculas en sistemas de biodetección miniaturizados en chip5. Sin embargo, las fuerzas magnéticas son significativamente más débiles que las fuerzas de arrastre a escala nanométrica debido a la alta relación superficie-volumen6. Por lo tanto, la captura de nanopartículas para pasos cruciales de inmunoensayo, como el lavado y la detección, puede ser un desafío, y un imán convencional es insuficiente4.
Una forma eficiente de manipular las nanopartículas es el uso de una trampa magnética microfluídica formada por micropartículas de hierro, que se empaquetan en una estructura microfluídica3. Por lo tanto, cuando un imán externo se acerca, se crea una interacción compleja dentro del medio poroso magnetizado entre las fuerzas magnéticas y de flujo. La fuerza magnética que actúa sobre las nanopartículas es lo suficientemente fuerte como para capturarlas y resistir el arrastre de flujo 3,4,7. Este enfoque requiere técnicas de microfabricación que logren resoluciones del orden de unos pocos micrómetros para generar estructuras micrométricas que retengan las micropartículas.
Las técnicas actuales de microfabricación permiten la fabricación de alta resolución de estructuras desde unas pocas micras hasta cientos de nanómetros8. Sin embargo, muchas de estas técnicas requieren equipos especializados, costosos o complicados. Una de las principales dificultades es la necesidad de una sala limpia para la fabricación de moldes, que sigue siendo costosa y requiere mucho tiempo 8,9. Recientemente, los ingenieros microfluídicos han superado este inconveniente mediante el desarrollo de una variedad de métodos de fabricación alternativos, con varias ventajas, como costos reducidos, tiempos de respuesta más rápidos, materiales y herramientas más baratos y una mayor funcionalidad8. De esta manera, el desarrollo de nuevas técnicas de microfabricación trajo métodos de bajo costo, no de sala limpia, que logran resoluciones tan bajas como 10 μm8. El modelado se puede utilizar directamente sobre un sustrato sin generar un patrón de moldeo costoso, evitando así un proceso que consume mucho tiempo. Los métodos de fabricación directa incluyen fresado CNC, ablación láser y litografía directa8. Todos estos métodos son adecuados para producir canales de alta relación de aspecto en una amplia gama de materiales, independientemente de su dureza9, lo que permite geometrías, comportamientos físicos y cualidades nuevas y ventajosas en dispositivos microfluídicos8.
El microfresado CNC crea estructuras a microescala utilizando herramientas de corte que eliminan el material a granel de un sustrato y es un método de fabricación eficaz para dispositivos microfluídicos10,11. La técnica de microfresado puede ser útil en aplicaciones microfluídicas para crear microcanales y características directamente en la superficie de trabajo, ofreciendo una ventaja clave: una pieza de trabajo se puede fabricar en poco tiempo (menos de 30 min), reduciendo significativamente el tiempo de respuesta desde el diseño hasta el prototipo12. Además, la amplia disponibilidad de accesorios de corte de diferentes materiales, tamaños y formas hace de las fresadoras CNC una herramienta adecuada que ha permitido la fabricación de diferentes características en muchos tipos de materiales desechables de bajo costo13.
Entre todos los materiales comúnmente utilizados en micromolienda, los termoplásticos siguen siendo una opción líder debido a sus muchas propiedades favorables y compatibilidad con aplicaciones biológicas10,14. Los termoplásticos son un sustrato atractivo para los sistemas microfluídicos debido a sus importantes ventajas para el desarrollo de sistemas analíticos desechables de bajo costo9. Además, estos materiales son altamente susceptibles a procesos de fabricación de alto volumen, lo que los hace adecuados para la comercialización y la producción en masa. Por estas razones, los termoplásticos como el PMMA han sido considerados materiales confiables y robustos desde los primeros años de la microfluídica10. Se han descrito diferentes protocolos para fabricar canales cerrados en termoplásticos, como la unión con solventes15, la unión térmica 16 y la unión de tratamiento superficial ultravioleta (UV) / ozono17.
En muchos casos, la resolución de posicionamiento alcanzada con las microfresadoras convencionales no es suficiente para algunas aplicaciones microfluídicas que requieren estructuras menores de 10 μm. La micromolienda de gama alta tiene suficiente resolución. Desafortunadamente, debido a los altos precios, su uso está limitado a un puñado de usuarios12. Anteriormente, nuestro grupo de investigación informó de la fabricación y manipulación de una herramienta de bajo coste que permite mecanizar estructuras de menos de 10 μm, superando la resolución de las fresadoras convencionales12. El accesorio es una plataforma fabricada mediante impresión 3D con electrónica simple, que contiene tres actuadores piezoeléctricos. La superficie contiene juntas en forma de bisagra que permiten levantarla cuando los elementos piezoeléctricos actúan simultáneamente. El desplazamiento del eje Z se puede controlar con una resolución de 500 nm y una precisión de ±1,5 μm12.
Este artículo presenta los pasos del proceso de fabricación de un dispositivo acrílico (PMMA) a través de una técnica de microfresado. El diseño del chip consiste en un canal principal de 200 μm de ancho y 200 μm de alto y un canal lateral con las mismas dimensiones para purgar el flujo de los reactivos. En la región central, el canal está interrumpido por una restricción física de solo 5 μm de altura, fabricada con la plataforma piezoeléctrica impresa en 3D hecha por este grupo12, para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética para nanopartículas colocando un imán externo. Mostramos el funcionamiento del dispositivo microfluídico realizando un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que lo hacen único4: el uso de nanopartículas magnéticas como soporte inmunológico reduce el tiempo total de prueba de horas a minutos; el uso de una enzima fluorogénica para la detección permite límites de detección que son comparables a los de los ensayos estándar de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA); y el uso de un termoplástico como material de fabricación lo hace compatible con la producción en masa, lo que no fue el caso de las trampas magnéticas de nanopartículas microfluídicasanteriores 3, y lo convierte en un excelente candidato para desarrollar POCT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se fabricó un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos utilizando nanopartículas como inmunosoporte utilizando una técnica de micromolienda. El método de fabricación directa sobre el sustrato tiene la ventaja de evitar el uso de un molde maestro y el tiempo y costes que ello implica. Sin embargo, se limita a la creación rápida de prototipos y la fabricación de dispositivos de alto volumen.
Aquí, utilizamos una plataforma piezoeléctrica accesoria previamente informada p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Conacyt, México bajo la subvención 312231 del Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación, y por la AMEXCID y la Secretaría de Relaciones Exteriores de México (SRE) bajo la subvención “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”. JAHO agradece a Conacyt México por su beca de doctorado.
Materials
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
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