Datamaskin numerisk kontroll Mikrofresing av en mikrofluidisk akrylenhet med en forskjøvet begrensning for magnetiske nanopartikkelbaserte immunoassays

Summary

Microfluidics er et kraftig verktøy for utvikling av diagnostiske tester. Imidlertid er det ofte nødvendig med dyrt utstyr og materialer, samt arbeidskrevende fabrikasjons- og håndteringsteknikker. Her beskriver vi fabrikasjonsprotokollen til en akrylmikrofluidisk enhet for magnetiske mikro- og nanopartikkelbaserte immunoassays i en rimelig og brukervennlig innstilling.

Abstract

Mikrofluidiske systemer har sterkt forbedret immunoassay teknikker. Imidlertid krever mange mikrofabrikasjonsteknikker spesialisert, dyrt eller komplisert utstyr, noe som gjør fabrikasjon kostbar og uforenlig med masseproduksjon, noe som er en av de viktigste forutsetningene for pasientnære tester (POCT) som skal tas i bruk i lavressursinnstillinger. Dette arbeidet beskriver fabrikasjonsprosessen av en akryl (polymetylmetakrylat, PMMA) enhet for nanopartikkel-konjugert enzymatisk immunoassay testing ved hjelp av datamaskinen numerisk kontroll (CNC) mikrofresing teknikk. Funksjonen til den mikrofluidiske enheten er vist ved å utføre en immunoassay for å oppdage et kommersielt antistoff ved bruk av lysozym som et modellantigen konjugert til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enheten integrerer en fysisk forskjøvet begrensning på bare 5 μm i høyden, som brukes til å fange magnetiske mikropartikler som utgjør en magnetisk felle ved å plassere en ekstern magnet. På denne måten er den magnetiske kraften på immunstøtten til konjugerte nanopartikler nok til å fange dem og motstå strømningsdrag. Denne mikrofluidiske enheten er spesielt egnet for billig masseproduksjon uten tap av presisjon for immunoassay-ytelse.

Introduction

De siste årene har mikrofluidikk spilt en viktig rolle i immunoassayteknikker¹. Miniatyriseringsteknologi har mange enestående fordeler sammenlignet med tradisjonelle immunoassays, for eksempel redusert prøve- og reagensforbruk, kortere inkubasjonstider, effektiv løsningsutveksling og høyere integrasjon og automatisering².

Videre reduserer mikrofluidiske systemer i immunoassays, i forbindelse med magnetiske nanopartikler som immunstøtte, inkubasjonstiden betydelig, og oppnår høy deteksjonsfølsomhet på grunn av økt overflate-til-volum-forhold³. Brownsk bevegelse av partiklene forbedrer reaksjonskinetikken under dannelsen av antigen-antistoffkomplekset ^4,5. Videre gir de magnetiske egenskapene til nanopartikler allsidigheten til å bli integrert i forskjellige mikrofluidiske enhetskonfigurasjoner, noe som gjør dem til en ideell kandidat for signalering og molekylfangst i miniatyriserte biosensingssystemer⁵. Imidlertid er magnetiske krefter betydelig svakere enn dragkrefter på nanometerskalaen på grunn av det høye forholdet mellom overflate og volum⁶. Derfor kan fangst av nanopartikler for viktige immunoassay-trinn som vasking og deteksjon være utfordrende, og en konvensjonell magnet er utilstrekkelig⁴.

En effektiv måte å manipulere nanopartiklene på er bruken av en mikrofluidisk magnetisk felle dannet av jernmikropartikler, som er pakket i en mikrofluidisk struktur³. Derfor, når en ekstern magnet nærmer seg, opprettes en kompleks interaksjon innenfor det magnetiserte porøse mediet mellom magnetiske og flukskrefter. Den magnetiske kraften som virker på nanopartiklene er sterk nok til å fange dem og motstå strømningsdrag ^3,4,7. Denne tilnærmingen krever mikrofabrikasjonsteknikker som oppnår oppløsninger i størrelsesorden noen få mikrometer for å generere mikrometriske strukturer som beholder mikropartiklene.

Nåværende mikrofabrikasjonsteknikker tillater høyoppløselig fabrikasjon av strukturer fra noen få mikron til hundrevis av nanometer⁸. Imidlertid krever mange av disse teknikkene spesialisert, dyrt eller komplisert utstyr. En av de største vanskelighetene er kravet om et renrom for muggfabrikasjon, som fortsatt er kostbart og tidkrevende ^8,9. Nylig har mikrofluidiske ingeniører overvunnet denne ulempen ved å utvikle en rekke alternative fabrikasjonsmetoder, med ulike fordeler som reduserte kostnader, raskere behandlingstid, billigere materialer og verktøy og økt funksjonalitet⁸. På denne måten førte utviklingen av nye mikrofabrikasjonsteknikker til lavkost, ikke-renromsmetoder som oppnår oppløsninger så lave som 10 μm⁸. Mønster kan brukes direkte på et underlag uten å generere et dyrt støpemønster, og dermed unngå en tidkrevende prosess. Direkte fabrikasjonsmetoder inkluderer CNC-fresing, laserablasjon og direkte litografi⁸. Alle disse metodene er egnet for å produsere kanaler med høyt aspektforhold i et bredt spekter av materialer, uavhengig av hardhet⁹, noe som muliggjør nye og fordelaktige geometrier, fysisk oppførsel og kvaliteter i mikrofluidiske enheter⁸.

CNC-mikrofresing skaper mikroskalastrukturer ved hjelp av skjæreverktøy som fjerner bulkmateriale fra et substrat og er en effektiv fabrikasjonsmetode for mikrofluidiske enheter^10,11. Mikrofreseteknikken kan være nyttig i mikrofluidiske applikasjoner for å lage mikrokanaler og funksjoner direkte på arbeidsflaten, noe som gir en viktig fordel: et arbeidsstykke kan fremstilles på kort tid (mindre enn 30 minutter), noe som reduserer behandlingstiden fra design til prototype¹² betydelig. I tillegg gjør den brede tilgjengeligheten av skjæretilbehør av forskjellige materialer, størrelser og former CNC-fresemaskiner til et egnet verktøy som har gjort det mulig å produsere forskjellige funksjoner i mange typer rimelige engangsmaterialer¹³.

Blant alle materialene som vanligvis brukes i mikrofresing, er termoplast fortsatt et ledende valg på grunn av deres mange gunstige egenskaper og kompatibilitet med biologiske applikasjoner^10,14. Termoplast er et attraktivt substrat for mikrofluidiske systemer på grunn av deres betydelige fordeler for å utvikle rimelige, engangsanalytiske systemer⁹. I tillegg er disse materialene svært mottagelige for produksjonsprosesser med høyt volum, noe som gjør dem egnet for kommersialisering og masseproduksjon. Av disse grunner har termoplast som PMMA blitt ansett som pålitelige og robuste materialer siden de tidlige årene av mikrofluidikk¹⁰. Ulike protokoller er beskrevet for å fremstille lukkede kanaler i termoplast, for eksempel løsningsmiddelbinding¹⁵, varmebinding 16 og ultrafiolett (UV) / ozon overflatebehandlingsbinding¹⁷.

I mange tilfeller er posisjoneringsoppløsningen oppnådd med konvensjonelle mikrofresemaskiner ikke tilstrekkelig for noen mikrofluidiske applikasjoner som krever strukturer mindre enn 10 μm. High-end mikromilling har nok oppløsning. Dessverre, på grunn av høye priser, er bruken begrenset til en håndfull brukere¹². Tidligere rapporterte vår forskningsgruppe fabrikasjon og manipulering av et billig verktøy som tillater maskineringsstrukturer på mindre enn 10 μm, overvinne oppløsningen til konvensjonelle fresemaskiner¹². Armaturen er en plattform produsert av 3D-utskrift med enkel elektronikk, som inneholder tre piezoelektriske aktuatorer. Overflaten inneholder hengselformede ledd som gjør at den kan løftes når de piezoelektriske elementene virker samtidig. Z-akseforskyvning kan styres med en oppløsning på 500 nm og en nøyaktighet på ± 1,5 μm¹².

Denne artikkelen presenterer trinnene i produksjonsprosessen til en akrylenhet (PMMA) gjennom en mikrofreseteknikk. Brikkedesignet består av en hovedkanal 200 μm bred og 200 μm høy og en sidekanal med samme dimensjoner for å rense strømmen av reagensene. I det sentrale området blir kanalen avbrutt av en fysisk begrensning på bare 5 μm i høyden, produsert med den 3D-printede piezoelektriske plattformen laget av denne gruppen¹², for å fange magnetiske mikropartikler som utgjør en magnetisk felle for nanopartikler ved å plassere en ekstern magnet. Vi viser driften av den mikrofluidiske enheten ved å utføre en immunoassay for å oppdage et kommersielt antistoff ved bruk av lysozym som et modellantigen konjugert til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enheten kombinerer forskjellige funksjoner som gjør den unik⁴: bruk av magnetiske nanopartikler som immunstøtte reduserer den totale testtiden fra timer til minutter; bruk av et fluorogent enzym for deteksjon muliggjør deteksjonsgrenser som er sammenlignbare med standard enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISAer); og bruken av en termoplast som fabrikasjonsmateriale gjør den kompatibel med masseproduksjon, noe som ikke var tilfelle for tidligere mikrofluidiske nanopartiklers magnetiske feller³, og gjør det til en utmerket kandidat til å utvikle POCT.

Protocol

1. Mikromilling OverflateslipingSlå på mikrofresemaskinen og den piezoelektriske kontrolleren. Start deres respektive kontrollprogramvare12. Velg de nødvendige endemøllebitene (200 μm og 800 μm diametre). Plasser dem i riktig rom på fresemaskinen (figur 1). Skjær 9 mm x 25 mm rektangler med 1,3 mm tykk PMMA med 800 μm endemøllebit. Fest en av disse rektanglene forsiktig med dobbeltsidig tape til den pi…

Representative Results

Det var mulig å etablere en svært reproduserbar fabrikasjonsprotokoll som forbedrer oppløsningen av den konvensjonelle mikrofreseteknikken. Ved hjelp av denne protokollen oppnås fabrikasjon av en kanal så liten som 5 μm i høyden som fungerer som en forskjøvet begrensning i en 200 μm høy kanal. Den enkle utformingen av den forskjøvne begrensningen fanger jernmikropartikler på 7,5 μm diameter som, når de komprimeres i mikrokanalen, tillater dannelsen av en magnetisk felle når en ekstern magnet nærmer seg en…

Discussion

En akryl mikrofluidisk enhet for immunoassays ved bruk av nanopartikler som immunosupport ble produsert ved hjelp av en mikrofreseteknikk. Metoden for direkte produksjon på underlaget har fordelen av å unngå bruk av en hovedform og tid og kostnader som dette innebærer. Det er imidlertid begrenset til rask prototyping og produksjon av enheter med høyt volum.

Her brukte vi en tidligere rapportert tilbehør piezoelektrisk plattform for fresemaskinen¹². Plattformen ble…

Materials

0.008 Endmill	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12
0.032 Endmill	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12
Carbonyl-iron microparticles	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
Chloroform	Fermont	6201	Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate
CMOS camera Moment	Teledyne Photometrics		Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood	Unknown	Unknown
Flexible Plastic Tubing	Tygon	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope	ZEISS	Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle	Loctite	98612
Homemade piezoelectric controller application	LabView		See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive	Henkel	49503	Apply with micropipette tip or dispensing needle
MagJET Separation Rack	thermoscientific		12 x 1.5 mL
Mechanic press	Home-made
Milling Machine	Roland	MDX-50
Piezoelectric platform	Home-made		See reference 12
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic	Goodfellow	ME303018/1	Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107	Image acquisition software
Stereo microscope	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Syringe pump	kd Scientific	KDS200	Can hold up to two syringes
Utrasonic bath	Branson	2800
VPanel software	Windows OS	Version 1.0.3.0	Software for controlling the micromilling machine