Mesure de la vasorelaxation dépendante de l’endothélium dans l’aorte thoracique de souris à l’aide de la myographie tensométrique à petit volume
Summary
Le présent protocole décrit les concepts et l’application technique de la technique du myographe tensométrique utilisant un système myographique à chambres multiples dans l’évaluation expérimentale ex vivo de la fonction endothéliale aortique de la souris.
Abstract
La myographie tensométrique à chambre de petit volume est une technique couramment utilisée pour évaluer la contractilité vasculaire des petits et grands vaisseaux sanguins chez les animaux de laboratoire et les petites artères isolées des tissus humains. La technique permet aux chercheurs de maintenir les vaisseaux sanguins isolés dans un environnement étroitement contrôlé et standardisé (quasi physiologique), avec la possibilité de s’adapter à divers facteurs environnementaux, tout en défiant les vaisseaux isolés avec différents agents pharmacologiques qui peuvent induire une vasoconstriction ou une vasodilatation. La chambre myographique fournit également une plate-forme pour mesurer la réactivité vasculaire en réponse à diverses hormones, inhibiteurs et agonistes qui peuvent avoir un impact sur la fonction des muscles lisses et des couches endothéliales séparément ou simultanément. La paroi des vaisseaux sanguins est une structure complexe composée de trois couches différentes: l’intima (couche endothéliale), les médias (muscles lisses et fibres d’élastine) et l’adventice (collagène et autres tissus conjonctifs). Pour bien comprendre les propriétés fonctionnelles de chaque couche, il est essentiel d’avoir accès à une plateforme et à un système expérimentaux qui permettraient une approche combinatoire pour étudier les trois couches simultanément. Une telle approche exige l’accès à une condition semi-physiologique qui imiterait l’environnement in vivo dans un contexte ex vivo . La myographie tensométrique à chambre de petits volumes a fourni un environnement idéal pour évaluer l’impact des indices environnementaux, des variables expérimentales ou des agonistes et antagonistes pharmacologiques sur les propriétés vasculaires. Pendant de nombreuses années, les scientifiques ont utilisé la technique du myographe tensométrique pour mesurer la fonction endothéliale et la contractilité des muscles lisses en réponse à différents agents. Dans ce rapport, un système myographique tensométrique à chambre de petit volume est utilisé pour mesurer la fonction endothéliale dans l’aorte isolée de la souris. Ce rapport se concentre sur la façon dont la myographie tensométrique à chambre de petit volume peut être utilisée pour évaluer l’intégrité fonctionnelle de l’endothélium dans de petits segments d’une grande artère telle que l’aorte thoracique.
Introduction
Au cours des dernières décennies, le système de myographie à petite chambre a été utilisé pour mesurer la réactivité de différentes couches de parois de vaisseaux sanguins en réponse à divers agents pharmacologiques et neurotransmetteurs dans un cadre ex vivo en temps réel. La réactivité vasculaire est une composante majeure d’un vaisseau sanguin fonctionnel sain et est essentielle à la régulation du flux sanguin et de la perfusion dans le système vasculaire périphérique et cérébral1. Dans la paroi des vaisseaux sanguins, l’interaction entre les couches endothéliales et musculaires lisses est un déterminant majeur du tonus vasculaire, qui est également constamment affecté par les changements structurels dans la couche de tissu conjonctif entourant la paroi des vaisseaux sanguins (adventice).
La couche endothéliale contrôle la vasomotion en libérant quelques facteurs vasodilatateurs, y compris l’oxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et le facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF), ou en produisant des agents vasoconstricteurs tels que l’endothéline-1 (ET-1) et le thromboxane (TXA2)2,3,4. Parmi ces facteurs, le NO a fait l’objet d’études approfondies et ses rôles régulateurs importants dans d’autres fonctions cellulaires critiques telles que l’inflammation, la migration, la survie et la prolifération ont été largement cités dans la littérature scientifique 2,5.
Dans le domaine de la biologie vasculaire, la myographie en chambre a fourni aux physiologistes et pharmacologues vasculaires un outil précieux et fiable pour mesurer la fonction endothéliale dans un système semi-physiologique étroitement contrôlé1. Actuellement, il existe deux systèmes myographiques différents à la disposition des scientifiques: la myographie tensométrique (isométrique) par fil (ou broches) et la myographie par pression. Dans un système de myographie filaire, le vaisseau sanguin est étiré entre deux fils ou broches, ce qui permet la mesure isométrique du développement de la force ou de la tension dans la paroi du vaisseau sanguin, tandis que la myographie par pression est une plate-forme préférable pour les mesures de la réactivité vasculaire dans les petites artères de résistance, où les changements de pression artérielle sont considérés comme le principal stimulus pour les changements de tonus vasculaire et de vasomotion. Il est généralement admis que, pour les petites artères de résistance telles que les artères mésentériques et cérébrales, la myographie par pression crée une condition plus proche des conditions physiologiques du corps humain. Le myographe à petite chambre peut être utilisé pour les vaisseaux de très petits diamètres (200-500 μm) à des vaisseaux beaucoup plus grands tels que l’aorte.
Alors que le myographe filaire est un système puissant pour enregistrer la tension des vaisseaux sanguins dans des conditions isométriques, le myographe à pression est un système plus approprié pour mesurer les changements de diamètre des vaisseaux en réponse aux changements des conditions isobares. Les changements de diamètre dans le vaisseau en réponse aux changements de pression ou de débit sont beaucoup plus importants dans une petite artère musculaire (artériole) par rapport aux grandes artères élastiques telles que l’aorte. Pour ces raisons, le myographe de pression est considéré comme un meilleur outil pour les petits vaisseaux sanguins avec une vasoréactivité substantielle1. L’une des autres forces pratiques de la myographie tensométrique à chambres multi-chambres à petits volumes est que l’on peut discerner la contribution de différents mécanismes à la réactivité vasculaire en étudiant plusieurs (jusqu’à quatre) segments de la même artère et du même animal pour réduire la variabilité et produire des données robustes et concluantes. Il est également relativement facile à configurer et à entretenir techniquement. Les vaisseaux de presque toutes les tailles peuvent être étudiés avec un myographe filaire. C’est une solution plus rentable pour évaluer la fonction vasculaire et une bonne alternative à la myographie par pression dans les expériences où la longueur du vaisseau disséqué est trop courte pour le protocole myographique de pression.
Ce rapport fournit un protocole détaillé pour l’évaluation de la fonction endothéliale dans l’anneau aortique thoracique isolé de souris à l’aide de broches de montage dans la technique de myographie tensométrique à chambre de petit volume utilisant le système myographique à plusieurs chambres DMT-620 (DMT-USA). Ce protocole utilise une souris C57BL6 mâle âgée de 6 mois avec un poids moyen compris entre 25 et 35 g. Heureusement, ce protocole peut être appliqué à divers types et poids d’animaux, compte tenu de la vaste gamme de types de navires et de diamètres pour lesquels ce protocole peut être utilisé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le domaine de la biologie vasculaire s’appuie fortement sur des outils qui aident les chercheurs à évaluer l’intégrité fonctionnelle et structurelle de la paroi des vaisseaux sanguins. Il exige également une attention particulière sur les interactions directes et indirectes entre les trois couches des vaisseaux sanguins: l’intima, les médias et l’adventice. Parmi ces trois couches, l’intima est formé d’une monocouche de cellules endothéliales et a une fonction très importante dans la régulation de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health (R15HL145646) et le Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
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