Medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en la aorta torácica del ratón mediante miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen
Summary
El presente protocolo describe los conceptos y la aplicación técnica de la técnica del miógrafo tensométrico utilizando un sistema de miógrafo multicámara en la evaluación experimental ex vivo de la función endotelial aórtica del ratón.
Abstract
La miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen es una técnica comúnmente utilizada para evaluar la contractilidad vascular de vasos sanguíneos pequeños y grandes en animales de laboratorio y arterias pequeñas aisladas de tejido humano. La técnica permite a los investigadores mantener vasos sanguíneos aislados en un entorno estrictamente controlado y estandarizado (casi fisiológico), con la opción de ajustarse a diversos factores ambientales, mientras desafía los vasos aislados con diferentes agentes farmacológicos que pueden inducir vasoconstricción o vasodilatación. La cámara miográfica también proporciona una plataforma para medir la reactividad vascular en respuesta a varias hormonas, inhibidores y agonistas que pueden afectar la función del músculo liso y las capas endoteliales por separado o simultáneamente. La pared del vaso sanguíneo es una estructura compleja que consta de tres capas diferentes: la íntima (capa endotelial), los medios (músculo liso y fibras de elastina) y la adventicia (colágeno y otro tejido conectivo). Para obtener una comprensión clara de las propiedades funcionales de cada capa, es fundamental tener acceso a una plataforma y sistema experimental que permita un enfoque combinacional para estudiar las tres capas simultáneamente. Tal enfoque exige el acceso a una condición semifisiológica que imitaría el entorno in vivo en un entorno ex vivo . La miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen ha proporcionado un entorno ideal para evaluar el impacto de las señales ambientales, las variables experimentales o los agonistas y antagonistas farmacológicos en las propiedades vasculares. Durante muchos años, los científicos han utilizado la técnica del miógrafo tensométrico para medir la función endotelial y la contractilidad del músculo liso en respuesta a diferentes agentes. En este informe, se utiliza un sistema miométrico tensométrico de cámara de pequeño volumen para medir la función endotelial en la aorta aislada del ratón. Este informe se centra en cómo se puede utilizar la miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen para evaluar la integridad funcional del endotelio en pequeños segmentos de una arteria grande como la aorta torácica.
Introduction
Durante las últimas décadas, el sistema de miografía de cámara pequeña se ha utilizado para medir la reactividad de diferentes capas de paredes de vasos sanguíneos en respuesta a diversos agentes farmacológicos y neurotransmisores en un entorno ex vivo y en tiempo real. La reactividad vascular es un componente importante de un vaso sanguíneo funcional sano y es crítica para la regulación del flujo sanguíneo y la perfusión en la vasculatura periférica y cerebral1. Dentro de la pared del vaso sanguíneo, la interacción entre las capas endotelial y del músculo liso es un determinante importante del tono vascular, que también se ve constantemente afectado por los cambios estructurales en la capa de tejido conectivo que rodea la pared del vaso sanguíneo (adventicia).
La capa endotelial controla la vasomoción liberando algunos factores vasodilatadores, incluyendo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF), o produciendo agentes vasoconstrictores como endotelina-1 (ET-1) y tromboxano (TXA2)2,3,4. Entre estos factores, el NO ha sido ampliamente estudiado, y sus importantes funciones reguladoras en otras funciones celulares críticas como la inflamación, la migración, la supervivencia y la proliferación han sido altamente citadas en la literatura científica 2,5.
En el campo de la biología vascular, la miografía de cámara ha proporcionado a los fisiólogos vasculares y farmacólogos una herramienta valiosa y confiable para medir la función endotelial en un sistema semifisiológico estrechamente controlado1. Actualmente, hay dos sistemas miográficos diferentes disponibles para los científicos: la miografía tensométrica (isométrica) de alambre (o pin) y la miografía de presión. En un sistema de miografía de alambre, el vaso sanguíneo se estira entre dos cables o clavos, lo que permite la medición isométrica del desarrollo de fuerza o tensión en la pared del vaso sanguíneo, mientras que la miografía de presión es una plataforma preferible para mediciones de reactividad vascular en arterias de resistencia pequeñas, donde los cambios en la presión arterial se consideran el principal estímulo para los cambios en el tono vascular y la vasomoción. Existe un acuerdo general de que, para las arterias de resistencia pequeñas, como las arterias mesentéricas y cerebrales, la miografía de presión crea una condición que está más cerca de las condiciones fisiológicas en el cuerpo humano. El miógrafo de cámara pequeña se puede utilizar para vasos con diámetros muy pequeños (200-500 μm) a vasos mucho más grandes como la aorta.
Mientras que el miógrafo de alambre es un sistema potente para registrar la tensión de los vasos sanguíneos en condiciones isométricas, el miógrafo de presión es un sistema más apropiado para medir los cambios en el diámetro del vaso en respuesta a los cambios en las condiciones isobáricas. Los cambios de diámetro en el vaso en respuesta a los cambios en la presión o el flujo son mucho mayores en una arteria muscular pequeña (arteriola) en comparación con las arterias elásticas grandes como la aorta. Por estas razones, el miógrafo de presión es considerado una mejor herramienta para los vasos sanguíneos pequeños con vasoreactividad sustancial1. Una de las otras fortalezas prácticas de la miografía tensométrica de cámara multicámara de pequeño volumen es que se puede discernir la contribución de diferentes mecanismos a la reactividad vascular mediante el estudio de múltiples (hasta cuatro) segmentos de la misma arteria y del mismo animal para reducir la variabilidad y producir datos robustos y concluyentes. También es relativamente fácil de configurar y mantener técnicamente. Los vasos de casi cualquier tamaño se pueden estudiar con un miógrafo de alambre. Es una solución más rentable para evaluar la función vascular y es una buena alternativa a la miografía de presión en experimentos donde la longitud del vaso disecado es demasiado corta para el protocolo del miógrafo de presión.
Este informe proporciona un protocolo detallado para la evaluación de la función endotelial en el anillo aórtico torácico aislado de ratón utilizando pines de montaje en la técnica de miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen utilizando el sistema de miógrafo multicámara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza un ratón macho C57BL6 de 6 meses de edad con un peso promedio entre 25-35 g. Afortunadamente, este protocolo se puede aplicar a varios tipos de animales y pesos, teniendo en cuenta la amplia gama de tipos de vasos y diámetros para los que se puede utilizar este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El campo de la biología vascular depende en gran medida de herramientas que ayudan a los investigadores a evaluar la integridad funcional y estructural de la pared del vaso sanguíneo. También exige una atención especial a las interacciones directas e indirectas entre las tres capas de los vasos sanguíneos: la íntima, la media y la adventicia. Entre esas tres capas, la íntima está formada por una monocapa de células endoteliales y tiene una función muy importante en la regulación de la salud vascular y la hemos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (R15HL145646) y Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
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