Tensometric Small Volume Chamber Myography 를 이용한 마우스 흉부 대동맥의 내피 의존성 혈관 이완 측정
Summary
본 프로토콜은 마우스 대동맥 내피 기능의 실험적 생체외 평가에서 다중 챔버 근초음파 시스템을 사용하는 텐소메트릭 근초음파 기술의 개념 및 기술적 적용을 기술한다.
Abstract
소체실 텐소메트릭 근조영술은 실험실 동물 및 인체 조직에서 분리된 소동맥에서 크고 작은 혈관의 혈관 수축성을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 기술입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 다양한 환경 요인에 적응할 수있는 옵션을 통해 엄격하게 통제되고 표준화 된 (거의 생리적) 환경에서 격리 된 혈관을 유지하면서 혈관 수축 또는 혈관 확장을 유도 할 수있는 다양한 약리학 적 약제로 격리 된 혈관에 도전 할 수 있습니다. 근압 챔버는 또한 평활근 및 내피층의 기능에 개별적으로 또는 동시에 영향을 미칠 수 있는 다양한 호르몬, 억제제 및 작용제에 대한 반응성 혈관 반응성을 측정하는 플랫폼을 제공합니다. 혈관벽은 내막 (내피 층), 매체 (평활근 및 엘라스틴 섬유) 및 외막 (콜라겐 및 기타 결합 조직)의 세 가지 층으로 구성된 복잡한 구조입니다. 각 레이어의 기능적 특성을 명확하게 이해하려면 세 레이어를 동시에 연구하는 조합 접근 방식을 허용하는 실험 플랫폼과 시스템에 액세스하는 것이 중요합니다. 이러한 접근 방식은 생체 외 환경에서 생체 내 환경을 모방하는 반 생리 학적 조건에 대한 액세스를 요구합니다. 소부피 챔버 텐소메트릭 근조영술은 환경 단서, 실험 변수 또는 약리학적 작용제 및 길항제가 혈관 특성에 미치는 영향을 평가하기에 이상적인 환경을 제공했습니다. 수년 동안 과학자들은 텐소 메트릭 근전도 기술을 사용하여 다양한 약제에 대한 반응으로 내피 기능과 평활근 수축력을 측정했습니다. 이 보고서에서는 분리된 마우스 대동맥에서 내피 기능을 측정하기 위해 작은 부피 챔버 텐소메트릭 근압계 시스템을 사용합니다. 이 보고서는 흉부 대동맥과 같은 큰 동맥의 작은 부분에서 내피의 기능적 완전성을 평가하기 위해 작은 부피 챔버 텐소 메트릭 근조영술을 사용하는 방법에 중점을 둡니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 소형 챔버 근조영술 시스템은 생체 외 실시간 환경에서 다양한 약리학적 제제 및 신경 전달 물질에 반응하여 혈관벽의 여러 층의 반응성을 측정하는 데 사용되었습니다. 혈관 반응성은 건강한 기능성 혈관의 주요 구성 요소이며 말초 및 뇌 혈관계의 혈류 및 관류 조절에 중요합니다1. 혈관벽 내에서 내피층과 평활근 층 사이의 상호 작용은 혈관 색조의 주요 결정 요인이며, 이는 또한 혈관벽을 둘러싼 결합 조직층의 구조적 변화(외막)에 의해 지속적으로 영향을 받습니다.
내피층은 산화질소(NO), 프로스타사이클린(PGI2) 및 내피 유래 과분극 인자(EDHF)를 포함한 몇 가지 혈관 확장 인자를 방출하거나 엔도텔린-1(ET-1) 및 트롬복산(TXA2)2,3,4와 같은 혈관 수축제를 생성하여 혈관 운동을 제어합니다. 이러한 요인 중 NO는 광범위하게 연구되었으며 염증, 이동, 생존 및 증식과 같은 다른 중요한 세포 기능에서 중요한 조절 역할은 과학 문헌 2,5에서 많이 인용되었습니다.
혈관 생물학 분야에서 챔버 근조영술은 혈관 생리학자와 약리학자에게 엄격하게 제어된 반생리학적 시스템에서 내피 기능을 측정할 수 있는 가치 있고 신뢰할 수 있는 도구를 제공했습니다1. 현재 과학자들이 사용할 수있는 두 가지 근전도 시스템이 있습니다 : 와이어 (또는 핀) 텐소 메트릭 (등척영) 근전도와 압력 근선 조영술. 와이어 근전도 시스템에서 혈관은 두 개의 와이어 또는 핀 사이에 뻗어 혈관 벽의 힘 또는 장력 발달의 등척성 측정을 허용하는 반면, 압력 근전도는 혈압의 변화가 혈관 색조 및 혈관 운동의 변화에 대한 주요 자극으로 간주되는 작은 저항 동맥에서 혈관 반응성 측정에 바람직한 플랫폼입니다. 장간막 및 대뇌 동맥과 같은 작은 저항 동맥의 경우 압력 근전도가 인체의 생리적 조건에 더 가까운 상태를 생성한다는 일반적인 동의가 있습니다. 작은 챔버 근전도는 대동맥과 같은 매우 작은 직경(200-500μm)의 혈관에서 훨씬 더 큰 혈관에 활용할 수 있습니다.
와이어 근전도는 등척성 조건에서 혈관 장력을 기록하는 강력한 시스템인 반면, 압력 근압계는 등압 조건의 변화에 대한 혈관 직경의 변화를 측정하는 데 더 적합한 시스템입니다. 압력이나 흐름의 변화에 반응하는 혈관의 직경 변화는 대동맥과 같은 큰 탄성 동맥에 비해 작은 근육 동맥 (세동맥)에서 훨씬 큽니다. 이러한 이유로 압력 근압계는 상당한혈관 1을 가진 작은 혈관에 더 나은 도구로 간주됩니다. 다중 챔버 소부피 챔버 텐소메트릭 근조영술의 또 다른 실용적인 강점 중 하나는 동일한 동맥의 여러 부분(최대 4개)과 동일한 동물을 연구하여 가변성을 줄이고 강력하고 결정적인 데이터를 생성함으로써 혈관 반응성에 대한 다양한 메커니즘의 기여를 식별할 수 있다는 것입니다. 또한 기술적으로 설정 및 유지 관리가 비교적 쉽습니다. 거의 모든 크기의 혈관은 와이어 근전도로 연구 할 수 있습니다. 이는 혈관 기능을 평가하기 위한 보다 비용 효율적인 솔루션이며 해부된 혈관의 길이가 압력 근전도 프로토콜에 비해 너무 짧은 실험에서 압력 근조영술에 대한 좋은 대안입니다.
이 보고서는 DMT-620 다중 챔버 근전도 시스템(DMT-USA)을 사용하는 소체적 챔버 텐소메트릭 근전도 기술에 장착 핀을 사용하여 분리된 마우스 흉부 대동맥 링의 내피 기능 평가를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 평균 체중이 25-35g 인 6 개월 된 수컷 C57BL6 마우스를 사용합니다. 다행히도이 프로토콜은이 프로토콜을 사용할 수있는 광범위한 용기 유형과 직경을 고려하여 다양한 동물 유형 및 무게에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈관 생물학 분야는 연구자가 혈관벽의 기능적 및 구조적 무결성을 평가하는 데 도움이되는 도구에 크게 의존합니다. 또한 혈관의 세 층, 즉 내막, 매체 및 외막 사이의 직간접 상호 작용에 특별한주의를 기울여야합니다. 이 세 가지 층 중 내막은 내피 세포의 단층에 의해 형성되며 혈관 건강과 지혈을 조절하는 데 매우 중요한 기능을 합니다.
내피 층의 손상은 죽상 동맥 경화…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (R15HL145646)과 미드 웨스턴 대학교 대학원 연구 대학의 자금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
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