Messung der endothelabhängigen Vasorelaxation in der thorakalen Aorta der Maus mittels tensometrischer Kleinvolumenkammermyographie
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Konzepte und die technische Anwendung der tensometrischen Myographentechnik unter Verwendung eines Mehrkammer-Myographensystems bei der experimentellen ex vivo Bewertung der Aortenendothelfunktion der Maus.
Abstract
Die tensometrische Myographie mit kleinen Kammern ist eine häufig verwendete Technik zur Beurteilung der vaskulären Kontraktilität kleiner und großer Blutgefäße bei Labortieren und kleinen Arterien, die aus menschlichem Gewebe isoliert wurden. Die Technik ermöglicht es Forschern, isolierte Blutgefäße in einer streng kontrollierten und standardisierten (nahezu physiologischen) Umgebung aufrechtzuerhalten, mit der Möglichkeit, sich an verschiedene Umweltfaktoren anzupassen, während die isolierten Gefäße mit verschiedenen pharmakologischen Wirkstoffen herausgefordert werden, die Vasokonstriktion oder Vasodilatation induzieren können. Die Myographenkammer bietet auch eine Plattform zur Messung der vaskulären Reaktivität als Reaktion auf verschiedene Hormone, Inhibitoren und Agonisten, die die Funktion der glatten Muskulatur und der Endothelschichten separat oder gleichzeitig beeinflussen können. Die Blutgefäßwand ist eine komplexe Struktur, die aus drei verschiedenen Schichten besteht: der Intima (Endothelschicht), den Medien (glatte Muskulatur und Elastinfasern) und der Adventitia (Kollagen und anderes Bindegewebe). Um ein klares Verständnis der funktionalen Eigenschaften jeder Schicht zu erhalten, ist es wichtig, Zugang zu einer experimentellen Plattform und einem System zu haben, die einen kombinierten Ansatz zur gleichzeitigen Untersuchung aller drei Schichten ermöglichen. Ein solcher Ansatz erfordert den Zugang zu einem semiphysiologischen Zustand, der die In-vivo-Umgebung in einer Ex-vivo-Umgebung nachahmen würde. Die tensometrische Myographie mit kleinen Kammern bietet eine ideale Umgebung, um die Auswirkungen von Umwelthinweisen, experimentellen Variablen oder pharmakologischen Agonisten und Antagonisten auf die vaskulären Eigenschaften zu bewerten. Seit vielen Jahren verwenden Wissenschaftler die tensometrische Myographie-Technik, um die Endothelfunktion und die Kontraktilität der glatten Muskulatur als Reaktion auf verschiedene Wirkstoffe zu messen. In diesem Bericht wird ein tensometrisches Myographiesystem mit kleinem Volumen verwendet, um die Endothelfunktion in der isolierten Mausaorta zu messen. Dieser Bericht konzentriert sich darauf, wie die tensometrische Myographie der kleinvolumigen Kammer verwendet werden kann, um die funktionelle Integrität des Endothels in kleinen Segmenten einer großen Arterie wie der thorakalen Aorta zu bewerten.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten wurde das kleine Kammermyographiesystem verwendet, um die Reaktivität verschiedener Schichten von Blutgefäßwänden als Reaktion auf verschiedene pharmakologische Wirkstoffe und Neurotransmitter in einer Ex-vivo-Echtzeitumgebung zu messen. Die vaskuläre Reaktivität ist ein wesentlicher Bestandteil eines gesunden funktionellen Blutgefäßes und entscheidend für die Regulierung des Blutflusses und der Durchblutung in peripheren und zerebralen Gefäßen1. Innerhalb der Blutgefäßwand ist die Interaktion zwischen endothelialen und glatten Muskelschichten eine wichtige Determinante des Gefäßtonus, der auch ständig durch strukturelle Veränderungen in der Bindegewebsschicht um die Blutgefäßwand (Adventitia) beeinflusst wird.
Die Endothelschicht steuert die Vasomotion, indem sie einige gefäßerweiternde Faktoren freisetzt, darunter Stickstoffmonoxid (NO), Prostacyclin (PGI2) und Endothel-abgeleiteter Hyperpolarisationsfaktor (EDHF), oder indem vasokonstriktive Mittel wie Endothelin-1 (ET-1) und Thromboxan (TXA2) 2,3,4 produziert werden. Unter diesen Faktoren wurde NO ausführlich untersucht, und seine wichtige regulatorische Rolle bei anderen kritischen zellulären Funktionen wie Entzündung, Migration, Überleben und Proliferation wurde in der wissenschaftlichen Literatur häufig zitiert 2,5.
Auf dem Gebiet der Gefäßbiologie hat die Kammermyographie Gefäßphysiologen und Pharmakologen ein wertvolles und zuverlässiges Werkzeug zur Messung der Endothelfunktion in einem streng kontrollierten semiphysiologischen System zur Verfügung gestellt1. Derzeit stehen Wissenschaftlern zwei verschiedene Myographensysteme zur Verfügung: Draht- (oder Pin-) tensometrische (isometrische) Myographie und Druckmyographie. In einem Drahtmyographiesystem wird das Blutgefäß zwischen zwei Drähten oder Stiften gestreckt, was die isometrische Messung der Kraft- oder Spannungsentwicklung in der Wand des Blutgefäßes ermöglicht, während die Druckmyographie eine bevorzugte Plattform für Messungen der vaskulären Reaktivität in kleinen Widerstandsarterien ist, wo Änderungen des Blutdrucks als Hauptstimulus für Veränderungen des Gefäßtonus und der Vasomotion angesehen werden. Es besteht allgemeine Übereinstimmung darüber, dass die Druckmyographie für kleine Widerstandsarterien wie Mesenterial- und Hirnarterien einen Zustand schafft, der den physiologischen Bedingungen im menschlichen Körper näher kommt. Der kleine Kammermyograph kann für Gefäße mit sehr kleinen Durchmessern (200-500 μm) bis hin zu viel größeren Gefäßen wie der Aorta verwendet werden.
Während der Drahtmyograph ein leistungsfähiges System zur Aufzeichnung der Blutgefäßspannung unter isometrischen Bedingungen ist, ist der Druckmyograph ein geeigneteres System zur Messung von Änderungen des Gefäßdurchmessers als Reaktion auf Änderungen der isobaren Bedingungen. Die Durchmesseränderungen im Gefäß als Reaktion auf Änderungen des Drucks oder des Flusses sind in einer kleinen Muskelarterie (Arteriole) im Vergleich zu großen elastischen Arterien wie der Aorta viel größer. Aus diesen Gründen gilt der Druckmyograph als besseres Werkzeug für kleine Blutgefäße mit erheblicher Vasoreaktivität1. Eine der weiteren praktischen Stärken der zehnometrischen Mehrkammer-Kammermikrosometrie mit kleinem Volumen besteht darin, dass man den Beitrag verschiedener Mechanismen zur vaskulären Reaktivität erkennen kann, indem man mehrere (bis zu vier) Segmente derselben Arterie und desselben Tieres untersucht, um die Variabilität zu reduzieren und robuste und schlüssige Daten zu liefern. Es ist auch technisch relativ einfach einzurichten und zu warten. Gefäße fast jeder Größe können mit einem Drahtmyographen untersucht werden. Es ist eine kostengünstigere Lösung zur Beurteilung der Gefäßfunktion und ist eine gute Alternative zur Druckmyographie in Experimenten, bei denen die Länge des sezierten Gefäßes für das Druckmyographenprotokoll zu kurz ist.
Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung der Endothelfunktion im isolierten Brustaortenring der Maus unter Verwendung von Montagestiften in der tensometrischen Myographietechnik der kleinen Kammerkammer unter Verwendung des Mehrkammer-Myographiesystems DMT-620 (DMT-USA). Dieses Protokoll verwendet eine 6 Monate alte männliche C57BL6-Maus mit einem Durchschnittsgewicht zwischen 25-35 g. Glücklicherweise kann dieses Protokoll auf verschiedene Tierarten und -gewichte angewendet werden, wenn man die breite Palette von Schiffstypen und -durchmessern berücksichtigt, für die dieses Protokoll verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Gebiet der vaskulären Biologie stützt sich stark auf Werkzeuge, die Forschern helfen, die funktionelle und strukturelle Integrität der Blutgefäßwand zu beurteilen. Es erfordert auch besondere Aufmerksamkeit für die direkten und indirekten Wechselwirkungen zwischen den drei Schichten der Blutgefäße: die Intima, die Medien und die Adventitia. Unter diesen drei Schichten wird die Intima durch eine Monoschicht von Endothelzellen gebildet und hat eine sehr wichtige Funktion bei der Regulierung der Gefäßgesundhei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health (R15HL145646) und des Midwestern University College of Graduate Studies unterstützt.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
