Mätning av endotelberoende vasorelaxation i musens bröstkorgsaorta med hjälp av tensometrisk småvolymkammarmyografi
Summary
Detta protokoll beskriver begreppen och den tekniska tillämpningen av den tensometriska myograftekniken med hjälp av ett flerkammarmyografsystem i den experimentella ex vivo-bedömningen av musens aortaendotelfunktion.
Abstract
Tensomerisk myografi med liten volymkammare är en vanligt förekommande teknik för att utvärdera den vaskulära kontraktiliteten hos små och stora blodkärl hos laboratoriedjur och små artärer isolerade från mänsklig vävnad. Tekniken gör det möjligt för forskare att upprätthålla isolerade blodkärl i en tätt kontrollerad och standardiserad (nästan fysiologisk) miljö, med möjlighet att anpassa sig till olika miljöfaktorer, samtidigt som de isolerade kärlen utmanas med olika farmakologiska medel som kan inducera vasokonstriktion eller vasodilatation. Myografkammaren ger också en plattform för att mäta vaskulär reaktivitet som svar på olika hormoner, hämmare och agonister som kan påverka funktionen hos glatt muskulatur och endotelskikt separat eller samtidigt. Blodkärlsväggen är en komplex struktur som består av tre olika lager: intima (endotelskiktet), media (glatt muskulatur och elastinfibrer) och adventitia (kollagen och annan bindväv). För att få en tydlig förståelse för de funktionella egenskaperna hos varje lager är det viktigt att ha tillgång till en experimentell plattform och ett system som möjliggör en kombinationsmetod för att studera alla tre lagren samtidigt. Ett sådant tillvägagångssätt kräver tillgång till ett semifysiologiskt tillstånd som skulle efterlikna in vivo-miljön i en ex vivo-miljö. Tensomemetrisk myografi med liten volymkammare har gett en idealisk miljö för att utvärdera effekterna av miljösignaler, experimentella variabler eller farmakologiska agonister och antagonister på vaskulära egenskaper. Under många år har forskare använt den tensometriska myograftekniken för att mäta endotelfunktion och glatt muskelkontraktilitet som svar på olika medel. I denna rapport används ett tensometriskt myografsystem med liten volym för att mäta endotelfunktionen i den isolerade musaortan. Denna rapport fokuserar på hur tensomemetrisk myografi med liten volymkammare kan användas för att utvärdera endotelets funktionella integritet i små segment av en stor artär, såsom bröstkorgsaorta.
Introduction
Under de senaste decennierna har det lilla kammarmyografisystemet använts för att mäta reaktiviteten hos olika lager av blodkärlsväggar som svar på olika farmakologiska medel och neurotransmittorer i en ex vivo realtidsinställning. Vaskulär reaktivitet är en viktig komponent i ett friskt funktionellt blodkärl och är avgörande för regleringen av blodflöde och perfusion i perifer och cerebral vaskulatur1. Inom blodkärlsväggen är interaktionen mellan endotel- och glattmuskelskikt en viktig faktor för vaskulär ton, som också ständigt påverkas av strukturella förändringar i bindvävsskiktet som omger blodkärlsväggen (adventitia).
Endotelskiktet kontrollerar vasomotion genom att frigöra några vasodilaterande faktorer, inklusive kväveoxid (NO), prostacyklin (PGI2) och endotel-härledd hyperpolariserande faktor (EDHF), eller genom att producera vasokonstriktiva medel såsom endotelin-1 (ET-1) och tromboxan (TXA2)2,3,4. Bland dessa faktorer har NO studerats omfattande, och dess viktiga reglerande roller i andra kritiska cellulära funktioner som inflammation, migration, överlevnad och proliferation har citerats mycket i vetenskaplig litteratur 2,5.
Inom kärlbiologin har kammarmyografi gett vaskulära fysiologer och farmakologer ett värdefullt och pålitligt verktyg för att mäta endotelfunktion i ett tätt kontrollerat halvfysiologiskt system1. För närvarande finns det två olika myografsystem tillgängliga för forskare: tråd (eller stift) tensometrisk (isometrisk) myografi och tryckmyografi. I ett trådmyografisystem sträcker sig blodkärlet mellan två ledningar eller stift, vilket möjliggör isometrisk mätning av kraft- eller spänningsutveckling i blodkärlets vägg, medan tryckmyografi är en föredragen plattform för mätningar av vaskulär reaktivitet i små motståndsartärer, där förändringar i blodtrycket anses vara den främsta stimulansen för förändringar i vaskulär ton och vasomotion. Det finns en allmän överenskommelse om att för små motståndsartärer som mesenteriska och cerebrala artärer skapar tryckmyografi ett tillstånd som ligger närmare de fysiologiska förhållandena i människokroppen. Den lilla kammarens myograf kan användas för kärl med mycket små diametrar (200-500 μm) till mycket större kärl som aorta.
Medan trådmyografen är ett kraftfullt system för att registrera blodkärlsspänning under isometriska förhållanden, är tryckmyografen ett mer lämpligt system för att mäta förändringar i kärldiameter som svar på förändringar i isobariska förhållanden. Diameterförändringarna i kärlet som svar på förändringar i tryck eller flöde är mycket större i en liten muskelartär (arteriol) jämfört med stora elastiska artärer som aorta. Av dessa skäl anses tryckmyografen vara ett bättre verktyg för små blodkärl med betydande vasoreaktivitet1. En av de andra praktiska styrkorna med tensomemetrisk myografi med små volymer med flera kammare är att man kan urskilja bidraget från olika mekanismer till vaskulär reaktivitet genom att studera flera (upp till fyra) segment av samma artär och från samma djur för att minska variationen och producera robusta och avgörande data. Det är också relativt enkelt att installera och underhålla tekniskt. Fartyg av nästan vilken storlek som helst kan studeras med en trådmyograf. Det är en mer kostnadseffektiv lösning för att bedöma vaskulär funktion och är ett bra alternativ till tryckmyografi i experiment där längden på det dissekerade kärlet är för kort för tryckmyografprotokollet.
Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för bedömning av endotelfunktionen i den isolerade musens bröstkorgsaorta-ring med hjälp av monteringsstift i den tensometriska myografitekniken med liten volymkammare med DMT-620 flerkammarmyografsystem (DMT-USA). Detta protokoll använder en 6 månader gammal manlig C57BL6-mus med en genomsnittlig vikt mellan 25-35 g. Lyckligtvis kan detta protokoll tillämpas på olika djurtyper och vikter, med tanke på det breda utbudet av kärltyper och diametrar som detta protokoll kan användas för.
Protocol
Representative Results
Discussion
Området vaskulär biologi är starkt beroende av verktyg som hjälper forskare att bedöma blodkärlsväggens funktionella och strukturella integritet. Det kräver också särskild uppmärksamhet på de direkta och indirekta interaktionerna mellan de tre lagren av blodkärl: intima, media och adventitia. Bland dessa tre lager bildas intima av ett monolager av endotelceller och har en mycket viktig funktion för att reglera vaskulär hälsa och hemostas.
Det är väl etablerat att eventuella s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (R15HL145646) och Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
