Provberedning för snabb lipidanalys i Drosophila-hjärnan med hjälp av matrisassisterad laserdesorption / jonisering masspektrometriavbildning
Summary
Syftet med detta protokoll är att ge detaljerad vägledning om korrekt provberedning för lipid- och metabolitanalys i små vävnader, såsom Drosophila-hjärnan , med hjälp av matrisassisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) masspektrometriavbildning.
Abstract
Lipidprofilering, eller lipidomik, är en väletablerad teknik som används för att studera hela lipidinnehållet i en cell eller vävnad. Information som förvärvats från lipidomik är värdefull för att studera de vägar som är involverade i utveckling, sjukdom och cellulär metabolism. Många verktyg och instrument har hjälpt lipidomikprojekt, framför allt olika kombinationer av masspektrometri och vätskekromatografitekniker. Matrisassisterad laserdesorption/jonisering masspektrometriavbildning (MALDI MSI) har nyligen framträtt som en kraftfull avbildningsteknik som kompletterar konventionella metoder. Denna nya teknik ger unik information om den rumsliga fördelningen av lipider i vävnadsfack, vilket tidigare var ouppnåeligt utan användning av överdrivna modifieringar. Provberedningen av MALDI MSI-metoden är kritisk och är därför fokus för detta dokument. Detta dokument presenterar en snabb lipidanalys av ett stort antal Drosophila-hjärnor inbäddade i optimal skärtemperaturförening (OCT) för att ge ett detaljerat protokoll för beredning av små vävnader för lipidanalys eller metabolit- och småmolekylanalys genom MALDI MSI.
Introduction
Lipider är involverade i ett brett spektrum av biologiska processer och kan i stort sett klassificeras i fem kategorier baserat på deras strukturella mångfald: fettsyror, triacylglyceroler (TAG), fosfolipider, sterollipider och sfingolipider1. De grundläggande funktionerna hos lipider är att tillhandahålla energikällor för biologiska processer (dvs. TAG) och bilda cellulära membran (dvs fosfolipider och kolesterol). Emellertid, ytterligare roller av lipider har noterats i utveckling och sjukdomar, och har studerats omfattande inom det biomedicinska området. Till exempel har rapporter visat att fettsyror av olika längd kan ha unika terapeutiska roller. Korta fettsyrakedjor kan vara involverade i försvarsmekanismer mot autoimmuna sjukdomar, medellånga fettsyrakedjor producerar metaboliter som kan mildra anfall och långa fettsyrakedjor genererar metaboliter som kan användas för att behandla metaboliska störningar2. I nervsystemet har glia-härledda kolesterol och fosfolipider visat sig vara avgörande för synaptogenes 3,4. Andra typer av lipider har visat löfte i medicinska applikationer, inklusive sfingolipider som används i läkemedelsleveranssystem och sackarolipider som används för att stödja immunsystemet 5,6. De många rollerna och potentiella terapeutiska tillämpningarna av lipider inom det biomedicinska området har gjort lipidomik – studien av vägar och interaktioner mellan cellulära lipider – till ett kritiskt och allt viktigare område.
Lipidomics använder analytisk kemi för att studera lipidomet i stor skala. De huvudsakliga experimentella metoderna som används inom lipidomik är baserade på masspektrometri (MS) i kombination med olika kromatografi- och jonmobilitetstekniker 7,8. Användningen av MS i området är fördelaktig på grund av dess höga specificitet och känslighet, förvärvshastighet och unika förmåga att (1) detektera lipider och lipidmetaboliter som förekommer även vid låga och övergående nivåer, (2) upptäcka hundratals olika lipidföreningar i ett enda experiment, (3) identifiera tidigare okända lipider och (4) skilja mellan lipidisomerer. Bland utvecklingen inom MS, inklusive desorptionselektrosprayjonisering (DESI), MALDI och sekundär jonmasspektrometri (SIMS), HAR MALDI MSI framstått som en kraftfull bildteknik som kompletterar konventionella MS-baserade metoder genom att ge unik information om den rumsliga fördelningen av lipider i vävnadsfack 9,10.
Det typiska arbetsflödet för lipidomik består av provberedning, datainsamling med hjälp av masspektrometriteknik och dataanalys11. Studien av lipider och metaboliter i prover har lett till framväxten av tekniker för att förstå de fysiologiska och patologiska förhållandena för metaboliska processer i organismer. Även om det är viktigt att förstå biologiska interaktioner gör känsligheten hos lipider och metaboliter dem svåra att avbilda och identifiera utan färgämnen eller annan modifiering. Förändringar i metabolitnivåer eller distribution kan leda till fenotypiska förändringar. Ett verktyg som används för metabolomisk profilering är MALDI MSI, en etikettfri, in situ-avbildningsteknik som kan detektera hundratals molekyler samtidigt. MALDI-avbildning möjliggör visualisering av metaboliter och lipider i prover samtidigt som deras integritet och rumsliga fördelning bevaras. Tidigare teknik för lipidprofilering involverade användning av radioaktiva kemikalier för att individuellt kartlägga lipider, medan MALDI-avbildning avstår från detta och möjliggör detektering av en rad lipider samtidigt.
Lipidmetabolism och homeostas spelar viktiga funktioner i cellfysiologin, såsom underhåll och utveckling av nervsystemet. En viktig aspekt av nervsystemets lipidmetabolism är lipidkänseln mellan nervceller och gliaceller, som förmedlas av molekylära bärarlipoproteiner, inklusive lipoprotein med mycket låg densitet (VLDL), lipoproteiner med låg densitet (LDL) och lipoproteiner med hög densitet (HDL)12. Lipoproteiner innehåller apolipoproteiner (Apo), såsom ApoB och ApoD, som fungerar som strukturella block av lipidlast och som ligander för lipoproteinreceptorer. Neuron-glia-överhörningen av lipider involverar flera spelare såsom glia-härledd ApoD, ApoE och ApoJ, och deras neuronala LDL-receptorer (LDLR)13,14. I Drosophila är apolipophorin, en medlem av ApoB-familjen, en stor hemolymflipidbärare15. Apolipophorin har två närbesläktade lipoforinreceptorer (LpR), LpR1 och LpR2, som är homologer av däggdjur LDLR15,16. I tidigare studier upptäcktes det astrocytutsöndrade lipokalinet Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av humant ApoD, och dess neuronala receptor LpR1 för att kooperativt förmedla neuron-glia lipid shuttling, vilket reglerar dendrit morfogenes17. Därför spekulerades det i att förlusten av LpR1 skulle orsaka en minskning av det totala lipidinnehållet i Drosophila-hjärnan. MALDI MSI skulle vara ett lämpligt verktyg för att profilera lipidinnehållet i små vävnader i LpR1−/− mutanta och vilda Drosophila-hjärnor, vilket demonstreras i denna studie.
Trots den växande populariteten hos MALDI MSI hindrar instrumentets höga kostnad och experimentella komplexitet ofta dess implementering i enskilda laboratorier. Således utförs de flesta MALDI MSI-studier med hjälp av delade kärnfaciliteter. Som med andra tillämpningar av MALDI MSI är en noggrann provberedningsprocess för lipidomik avgörande för att uppnå tillförlitliga resultat. Men eftersom provbildsberedning vanligtvis utförs i enskilda forskningslaboratorier finns det en möjlighet till variation i MALDI MSI-förvärv. För att bekämpa detta syftar detta dokument till att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för provberedning av små biologiska prover före MALDI MSI-mätning med lipidanalys av en stor grupp vuxna Drosophila-hjärnor i positivt jonläge som ett exempel11,17. Vissa fosfolipidklasser och majoriteten av små metaboliter detekteras emellertid positivt genom MALDI-avbildning i negativt jonläge, vilket beskrivits tidigare11. Därför, med dessa två exempelstudier, hoppas vi kunna tillhandahålla detaljerade provberedningsprotokoll av olika kombinationer: fristående stor vävnad kontra inbäddad liten vävnad, upptining kontra varmglidning och positivt jonläge kontra negativt jonläge.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som visats i studien om variationerna i lipidsammansättning i mutanta och vilda Drosophila-hjärnor kan MALDI MSI vara en värdefull etikettfri bildteknik för in situ-analys av molekylära distributionsmönster i organ av små insekter. Eftersom lipider distribueras i både hjärnvävnaden och fettkropparna i Drosophila-huvuden, kan konventionella lipidomikmetoder baserade på vätskekromatografi och masspektrometri (LC-MS) endast detektera kombinerade signaler från båda regionerna när ext…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy och Mayan Hein stöds av Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin stöds av det intramurala forskningsprogrammet för National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Stöd för detta projekt gavs av ett PSC-CUNY-pris till Ye He och Rinat Abzalimov, gemensamt finansierat av The Professional Staff Congress och City University of New York.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
