הכנת דגימה לניתוח שומנים מהיר במוח דרוזופילה באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של ספיחה/יינון בלייזר בסיוע מטריצה
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת דגימה נכונה לניתוח שומנים ומטבוליטים ברקמות קטנות, כגון מוח דרוזופילה , באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסות בסיוע מטריצה.
Abstract
פרופיל שומנים, או lipidomics, היא טכניקה מבוססת היטב המשמשת לחקר כל תוכן השומנים של תא או רקמה. מידע הנרכש מליפידומיקה הוא בעל ערך בחקר המסלולים המעורבים בהתפתחות, מחלות ומטבוליזם תאי. כלים ומכשור רבים סייעו לפרויקטים של ליפידומיקה, בעיקר שילובים שונים של ספקטרומטריית מסות וטכניקות כרומטוגרפיה נוזלית. דימות ספקטרומטריית מסות (MALDI MSI) בסיוע מטריקס התגלה לאחרונה כטכניקת הדמיה רבת עוצמה המשלימה גישות קונבנציונליות. טכניקה חדשנית זו מספקת מידע ייחודי על ההתפלגות המרחבית של שומנים בתוך תאי רקמות, אשר בעבר לא ניתן היה להשיג ללא שימוש בשינויים מוגזמים. הכנת המדגם של גישת MALDI MSI היא קריטית, ולכן היא המוקד של מאמר זה. מאמר זה מציג ניתוח שומנים מהיר של מספר רב של מוחות Drosophila המשובצים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) כדי לספק פרוטוקול מפורט להכנת רקמות קטנות לניתוח שומנים או מטבוליט ומולקולות קטנות באמצעות MALDI MSI.
Introduction
ליפידים מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים וניתן לסווגם באופן נרחב לחמש קטגוריות בהתבסס על המגוון המבני שלהם: חומצות שומן, טריאצילגליצרולים (TAGs), פוספוליפידים, ליפידים סטרולים וספינגוליפידים1. הפונקציות הבסיסיות של שומנים הן לספק מקורות אנרגיה לתהליכים ביולוגיים (כלומר, TAGs) וליצור ממברנות תאיות (כלומר, פוספוליפידים וכולסטרול). עם זאת, תפקידים נוספים של שומנים נצפו בהתפתחות ובמחלות, ונחקרו בהרחבה בתחום הביו-רפואי. לדוגמה, דיווחים הראו כי חומצות שומן באורכים שונים עשויות להיות בעלות תפקידים טיפוליים ייחודיים. שרשראות קצרות של חומצות שומן יכולות להיות מעורבות במנגנוני הגנה מפני מחלות אוטואימוניות, שרשראות של חומצות שומן באורך בינוני מייצרות מטבוליטים שיכולים למתן התקפים, ושרשראות ארוכות של חומצות שומן מייצרות מטבוליטים שיכולים לשמש לטיפול בהפרעות מטבוליות2. במערכת העצבים, כולסטרול ופוספוליפידים שמקורם בגליה הוכחו כחיוניים לסינפטוגנזה 3,4. סוגים אחרים של שומנים הראו הבטחה ביישומים רפואיים, כולל ספינגוליפידים המשמשים במערכות אספקת תרופות וסכרוליפידים המשמשים לתמיכה במערכת החיסון 5,6. התפקידים הרבים והיישומים הטיפוליים הפוטנציאליים של שומנים בתחום הביו-רפואי הפכו את הליפידומיה – חקר המסלולים והאינטראקציות של ליפידים תאיים – לתחום קריטי וחשוב יותר ויותר.
ליפידומיקה עושה שימוש בכימיה אנליטית כדי לחקור את הליפידום בקנה מידה גדול. שיטות הניסוי העיקריות המשמשות בליפידומיקה מבוססות על ספקטרומטריית מסה (MS) בשילוב עם כרומטוגרפיה וטכניקות שונות של ניידות יונים 7,8. השימוש בטרשת נפוצה באזור הוא יתרון בשל הספציפיות והרגישות הגבוהה שלה, מהירות הרכישה והיכולות הייחודיות שלה (1) לזהות שומנים ומטבוליטים של שומנים המתרחשים גם ברמות נמוכות וחולפות, (2) לזהות מאות תרכובות שומנים שונות בניסוי יחיד, (3) לזהות שומנים שלא היו ידועים קודם לכן, ו-(4) להבחין בין איזומרים של שומנים. בין ההתפתחויות בטרשת נפוצה, כולל יינון אלקטרוספריי של ספיגה (DESI), MALDI וספקטרומטריית מסת יונים משנית (SIMS), MALDI MSI התפתחה כטכניקת הדמיה רבת עוצמה המשלימה גישות קונבנציונליות מבוססות MS על ידי מתן מידע ייחודי על ההתפלגות המרחבית של שומנים בתוך תאי רקמה 9,10.
זרימת העבודה הטיפוסית של lipidomics מורכבת מהכנת מדגם, רכישת נתונים באמצעות טכנולוגיית ספקטרומטריית מסה, וניתוח נתונים11. המחקר של שומנים ומטבוליטים בדגימות הוביל להופעת טכניקות להבנת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של תהליכים מטבוליים באורגניזמים. בעוד שהבנת אינטראקציות ביולוגיות חשובה, הרגישות של שומנים ומטבוליטים מקשה על הדמיה וזיהוי ללא צבעים או שינויים אחרים. שינויים ברמות המטבוליטים או בהתפלגותם עלולים להוביל לשינויים פנוטיפיים. אחד הכלים המשמשים ליצירת פרופילים מטבוליים הוא MALDI MSI, טכניקת הדמיה באתרה נטולת תוויות המסוגלת לזהות מאות מולקולות בו זמנית. הדמיית MALDI מאפשרת הדמיה של מטבוליטים ושומנים בדגימות תוך שמירה על שלמותם והתפלגותם המרחבית. טכנולוגיה קודמת ליצירת פרופילים של שומנים כללה שימוש בכימיקלים רדיואקטיביים למיפוי שומנים בנפרד, בעוד שהדמיית MALDI מוותרת על כך ומאפשרת זיהוי של מגוון שומנים בו זמנית.
מטבוליזם של שומנים והומאוסטזיס ממלאים תפקידים חשובים בפיזיולוגיה של התא, כגון תחזוקה ופיתוח של מערכת העצבים. היבט חיוני אחד של חילוף החומרים של שומנים במערכת העצבים הוא סגירת השומנים בין תאי עצב לתאי גליה, המתווכת על ידי ליפופרוטאינים נשאים מולקולריים, כולל ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDL) וליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDL)12. ליפופרוטאינים מכילים אפוליפופרוטאינים (Apo), כגון ApoB ו-ApoD, המתפקדים כבלוקים מבניים של מטען שומנים וכליגנדות לקולטני ליפופרוטאין. ה-neuron-glia crosstalk של השומנים כולל מספר שחקנים כגון ApoD, ApoE ו-ApoJ שמקורם בגליה, וקולטני ה-LDL העצביים שלהם (LDLRs)13,14. בדרוזופילה, אפוליפופורין, בן למשפחת ה-ApoB, הוא נשא שומנים המולימפי15. לאפוליפופורין יש שני קולטני ליפופורין קרובים (LpRs), LpR1 ו-LpR2, שהם הומולוגים של יונקים LDLR15,16. במחקרים קודמים התגלו הליפוקלין גליאל לזארילו (GLaz) המופרש על ידי אסטרוציטים, הומולוג דרוזופילה של ApoD אנושי, והקולטן העצבי שלו LpR1 כדי לתווך בשיתוף פעולה את סגירת השומנים של נוירון-גליה, ובכך מווסת את מורפוגנזה דנדריט17. לכן, הועלתה השערה כי אובדן של LpR1 יגרום לירידה בתכולת השומנים הכוללת במוח Drosophila. MALDI MSI יהיה כלי מתאים ליצירת פרופיל של תכולת השומנים ברקמות קטנות של LpR1−/− מוחות דרוזופילה מוטנטיים ופראיים, כפי שהוכח במחקר זה.
למרות הפופולריות הגוברת של MALDI MSI, העלות הגבוהה של המכשיר ומורכבות הניסוי מעכבות לעתים קרובות את יישומו במעבדות בודדות. לפיכך, רוב מחקרי MALDI MSI נערכים באמצעות מתקני ליבה משותפים. כמו ביישומים אחרים של MALDI MSI, תהליך הכנת דגימה זהיר עבור lipidomics הוא קריטי כדי להשיג תוצאות אמינות. עם זאת, מכיוון שהכנת שקופיות לדוגמה מתבצעת בדרך כלל במעבדות מחקר בודדות, קיימת אפשרות של שונות ברכישת MALDI MSI. כדי להילחם בכך, מאמר זה נועד לספק פרוטוקול מפורט להכנת דגימות ביולוגיות קטנות לפני מדידת MALDI MSI באמצעות ניתוח שומנים של קבוצה גדולה של מוחות דרוזופילה בוגרים במצב יון חיובי כדוגמה11,17. עם זאת, כמה מחלקות פוספוליפידים ורוב המטבוליטים הקטנים מזוהים לטובה על ידי הדמיית MALDI במצב יון שלילי, שתואר קודםלכן 11. לכן, בעזרת שני מחקרים לדוגמה אלה, אנו מקווים לספק פרוטוקולי הכנת דגימות מפורטים של שילובים שונים: רקמה גדולה העומדת בפני עצמה לעומת רקמה קטנה מוטבעת, הרכבה על הפשרה לעומת הרכבה בהחלקה חמה, ומצב יון חיובי לעומת מצב יון שלילי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שהוכח במחקר על השינויים בהרכב השומנים במוחות דרוזופילה מוטנטיים ופראיים, MALDI MSI יכולה להיות טכניקת הדמיה רבת ערך ללא תוויות לניתוח in situ של דפוסי התפלגות מולקולרית בתוך איברים של חרקים קטנים. ואכן, מאחר שליפידים מופצים הן ברקמת המוח והן בגופי השומן של ראשי דרוזופילה, גישו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
יוקי X. צ’ן, קלי ורסאמי ומאיה היין נתמכים על ידי תוכנית מחקר הקיץ של קרן סלואן CUNY (CSURP). ג’ון יין נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-מוחית של המכונים הלאומיים לבריאות פרויקט מספר 1ZIANS003137. התמיכה בפרויקט זה ניתנה על ידי פרס PSC-CUNY ל- Ye He ורינת אבזלימוב, במימון משותף של קונגרס הצוות המקצועי ואוניברסיטת העיר ניו יורק.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
