매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 이미징 을 사용한 초파리 뇌의 신속한 지질 분석을 위한 샘플 준비
Summary
이 프로토콜의 목적은 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분광법 이미징을 사용하여 초파리 뇌와 같은 작은 조직에서 지질 및 대사 산물 분석을위한 적절한 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.
Abstract
지질 프로파일 링 또는 지질학은 세포 또는 조직의 전체 지질 함량을 연구하는 데 사용되는 잘 정립 된 기술입니다. 지질학에서 얻은 정보는 발달, 질병 및 세포 대사와 관련된 경로를 연구하는 데 유용합니다. 많은 도구와 계측기가 지질학 프로젝트, 특히 질량 분광법과 액체 크로마토그래피 기술의 다양한 조합을 도왔습니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 이미징(MALDI MSI)은 최근 기존의 접근 방식을 보완하는 강력한 이미징 기술로 부상했습니다. 이 새로운 기술은 조직 구획 내의 지질의 공간적 분포에 대한 독특한 정보를 제공하며, 이전에는 과도한 변형을 사용하지 않고는 달성 할 수 없었습니다. MALDI MSI 접근법의 샘플 준비는 매우 중요하며, 따라서 이 논문의 초점입니다. 이 논문은 MALDI MSI를 통한 지질 분석 또는 대사 산물 및 소분자 분석을위한 작은 조직의 제조를위한 상세한 프로토콜을 제공하기 위해 최적의 절단 온도 화합물 (OCT)에 내장 된 많은 수의 초파리 뇌의 신속한 지질 분석을 제시합니다.
Introduction
지질은 광범위한 생물학적 과정에 관여하며 구조적 다양성에 따라 크게 다섯 가지 범주로 분류 될 수 있습니다 : 지방산, 트리아실 글리세롤 (TAG), 인지질, 스테롤 지질 및 스핑고지질1. 지질의 기본 기능은 생물학적 과정 (즉, TAG)을위한 에너지 원을 제공하고 세포막 (즉, 인지질과 콜레스테롤)을 형성하는 것입니다. 그러나 지질의 추가 역할은 발달 및 질병에서 주목 받아 왔으며 생물 의학 분야에서 광범위하게 연구되어 왔습니다. 예를 들어, 다른 길이의 지방산이 독특한 치료 역할을 할 수 있다는 보고서가 있습니다. 짧은 지방산 사슬은 자가면역 질환에 대한 방어 기작에 관여할 수 있고, 중간 길이의 지방산 사슬은 발작을 완화시킬 수 있는 대사산물을 생성하며, 긴 지방산 사슬은 대사 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 대사산물을 생성한다2. 신경계에서 글리아 유래 콜레스테롤과 인지질은 시냅토제네시스 생성에 필수적인 것으로 나타났습니다 3,4. 다른 유형의 지질은 약물 전달 시스템에 사용되는 스핑고지질과 면역계5,6을 지원하는 데 사용되는 사카롤리피드를 포함하여 의료 응용에서 약속을 나타냈다. 생물 의학 분야에서 지질의 수많은 역할과 잠재적 인 치료 응용 프로그램은 지질학 – 세포 지질의 경로와 상호 작용에 대한 연구 -를 중요하고 점점 더 중요한 분야로 만들었습니다.
지질학은 분석 화학을 사용하여 지질을 대규모로 연구합니다. 지질학에서 활용되는 주요 실험 방법은 다양한 크로마토그래피 및 이온 이동성 기술 7,8과 결합 된 질량 분광법 (MS)을 기반으로합니다. 이 영역에서 MS의 사용은 (1) 낮고 일시적인 수준에서도 발생하는 지질 및 지질 대사 산물을 검출하고, (2) 단일 실험에서 수백 개의 상이한 지질 화합물을 검출하고, (3) 이전에 알려지지 않은 지질을 확인하고, (4) 지질 이성질체를 구별하는 높은 특이성 및 민감도, 획득 속도 및 독특한 능력으로 인해 유리하다. 탈착 전기 분무 이온화 (DESI), MALDI 및 이차 이온 질량 분광법 (SIMS)을 포함한 MS의 개발 중 MALDI MSI는 조직 구획 내 지질의 공간 분포에 대한 고유 한 정보를 제공함으로써 기존의 MS 기반 접근법을 보완하는 강력한 이미징 기술로 부상했습니다 9,10.
지질학의 전형적인 워크플로우는 샘플 준비, 질량 분광법 기술을 이용한 데이터 수집, 및 데이터 분석(11)으로 구성된다. 샘플에서 지질 및 대사 산물에 대한 연구는 유기체의 대사 과정의 생리 학적 및 병리학 적 조건을 이해하는 기술의 출현으로 이어졌습니다. 생물학적 상호 작용을 이해하는 것이 중요하지만, 지질과 대사 산물의 민감성은 염료 나 다른 변형없이 이미지화하고 식별하기가 어렵습니다. 대사 산물 수준 또는 분포의 변화는 표현형 변화로 이어질 수 있습니다. 대사체 프로파일링에 사용되는 도구 중 하나는 수백 개의 분자를 동시에 검출할 수 있는 라벨이 없는 현장 이미징 기술인 MALDI MSI입니다. MALDI 이미징은 샘플에서 대사 산물과 지질을 시각화하는 동시에 무결성과 공간 분포를 보존합니다. 지질 프로파일 링을위한 이전 기술은 지질을 개별적으로 매핑하기 위해 방사성 화학 물질을 사용하는 것을 포함했지만 MALDI 이미징은이를 무시하고 다양한 지질을 동시에 탐지 할 수 있습니다.
지질 대사 및 항상성은 신경계의 유지 및 발달과 같은 세포 생리학에서 중요한 기능을 수행합니다. 신경계 지질 대사의 한 가지 필수적인 측면은 뉴런과 신경교 세포 사이의 지질 떨림이며, 이는 초저밀도 지단백질 (VLDL), 저밀도 지단백질 (LDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)12을 포함한 분자 운반체 지단백질에 의해 매개됩니다. 지단백질은 ApoB 및 ApoD와 같은 아포리포단백질(Apo)을 함유하고 있으며, 이는 지질화물의 구조적 블록과 지단백질 수용체의 리간드로 기능한다. 지질의 뉴런-글리아 크로스토크는 글리아-유래 ApoD, ApoE, 및 ApoJ, 및 그들의 뉴런 LDL 수용체(LDLRs)13,14와 같은 다수의 플레이어를 포함한다. 초파리에서, ApoB 패밀리의 구성원인 아포리포린은 주요 용혈림프 지질 담체(15)이다. 아포리포린은 포유동물 LDLR15,16의 상동체인 두 개의 밀접하게 관련된 리포포린 수용체(LpRs), LpR1 및 LpR2를 갖는다. 이전 연구에서, 성상세포 분비 리포칼린 글리알 라자릴로 (GLaz), 인간 ApoD의 초파리 상동체, 및 그의 뉴런 수용체 LpR1이 뉴런-글리아 지질 떨림을 협력적으로 매개하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 수상 돌기 형태형성17을 조절한다. 따라서 LpR1의 손실은 초파리 뇌의 전반적인 지질 함량의 감소를 일으킬 것이라고 추측되었습니다. MALDI MSI는 본 연구에서 입증된 바와 같이 LpR1–/- 돌연변이체 및 야생형 초파리 뇌의 작은 조직에서 지질 내용물을 프로파일링하는 데 적합한 도구가 될 것이다.
MALDI MSI의 인기가 높아지고 있음에도 불구하고, 장비의 높은 비용과 실험적 복잡성은 종종 개별 실험실에서의 구현을 방해합니다. 따라서 대부분의 MALDI MSI 연구는 공유 핵심 시설을 사용하여 수행됩니다. MALDI MSI의 다른 적용과 마찬가지로, 지질학을 위한 신중한 샘플 준비 과정은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 그러나, 샘플 슬라이드 준비는 일반적으로 개별 연구 실험실에서 수행되기 때문에, MALDI MSI 획득에 변동의 가능성이 있다. 이를 방지하기 위해, 본 논문은 실시예11,17로서 양성 이온 모드에서 성인 초파리 뇌의 큰 그룹의 지질 분석을 사용하여 MALDI MSI 측정 이전에 작은 생물학적 샘플의 샘플 제조를 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 한다. 그러나, 일부 인지질 부류 및 대부분의 작은 대사산물은 이전에 기술된 음이온 모드에서 MALDI 영상화에 의해 유리하게 검출되고, 이는 앞서11에서 기술되었다. 따라서이 두 가지 예제 연구를 통해 우리는 독립형 대형 조직 대 임베디드 작은 조직, 해동 장착 대 웜 슬라이드 장착, 포지티브 이온 모드 대 음이온 모드 등 다양한 조합의 상세한 샘플 준비 프로토콜을 제공하기를 희망합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
돌연변이 및 야생형 초파리 뇌에서 지질 조성의 변화에 관한 연구에서 입증된 바와 같이, MALDI MSI는 작은 곤충의 기관 내의 분자 분포 패턴의 현장 분석을 위한 귀중한 라벨이 없는 이미징 기술이 될 수 있다. 실제로, 지질은 초파리 머리의 뇌 조직과 지방체 모두에 분포하기 때문에, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 (LC-MS)에 기초한 기존의 지질학 접근법은 전체 머리 추출?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy 및 Mayan Hein은 Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP)의 지원을 받습니다. Jun Yin은 National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다. 이 프로젝트에 대한 지원은 PSC-CUNY Award를 통해 Ye He와 Rinat Abzalimov에게 제공되었으며, The Professional Staff Congress와 The City University of New York이 공동으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
