Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz
Summary
El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación adecuada de la muestra para el análisis de lípidos y metabolitos en tejidos pequeños, como el cerebro de Drosophila , utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).
Abstract
El perfil lipídico, o lipidómica, es una técnica bien establecida utilizada para estudiar todo el contenido de lípidos de una célula o tejido. La información adquirida de la lipidómica es valiosa para estudiar las vías involucradas en el desarrollo, la enfermedad y el metabolismo celular. Muchas herramientas e instrumentaciones han ayudado a proyectos de lipidómica, especialmente varias combinaciones de técnicas de espectrometría de masas y cromatografía líquida. La espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI MSI) ha surgido recientemente como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales. Esta novedosa técnica proporciona información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares, que antes era inalcanzable sin el uso de modificaciones excesivas. La preparación de muestras del enfoque MALDI MSI es fundamental y, por lo tanto, es el foco de este documento. Este artículo presenta un análisis rápido de lípidos de un gran número de cerebros de Drosophila incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para proporcionar un protocolo detallado para la preparación de tejidos pequeños para el análisis de lípidos o análisis de metabolitos y moléculas pequeñas a través de MALDI MSI.
Introduction
Los lípidos están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos y pueden clasificarse ampliamente en cinco categorías basadas en su diversidad estructural: ácidos grasos, triacilgliceroles (TAG), fosfolípidos, lípidos de esteroles y esfingolípidos1. Las funciones fundamentales de los lípidos son proporcionar fuentes de energía para los procesos biológicos (es decir, TAG) y formar membranas celulares (es decir, fosfolípidos y colesterol). Sin embargo, se han observado funciones adicionales de los lípidos en el desarrollo y las enfermedades, y se han estudiado ampliamente en el campo biomédico. Por ejemplo, los informes han demostrado que los ácidos grasos de diferentes longitudes pueden tener funciones terapéuticas únicas. Las cadenas cortas de ácidos grasos pueden estar involucradas en los mecanismos de defensa contra enfermedades autoinmunes, las cadenas de ácidos grasos de longitud media producen metabolitos que pueden mitigar las convulsiones y las cadenas largas de ácidos grasos generan metabolitos que pueden usarse para tratar trastornos metabólicos2. En el sistema nervioso, el colesterol derivado de la glía y los fosfolípidos han demostrado ser vitales para la sinaptogénesis 3,4. Otros tipos de lípidos se han mostrado prometedores en aplicaciones médicas, incluyendo esfingolípidos utilizados en sistemas de administración de fármacos y sacarolípidos utilizados para apoyar el sistema inmunológico 5,6. Las numerosas funciones y posibles aplicaciones terapéuticas de los lípidos en el campo biomédico han hecho de la lipidómica, el estudio de las vías e interacciones de los lípidos celulares, un campo crítico y cada vez más importante.
La lipidómica hace uso de la química analítica para estudiar el lipidoma a gran escala. Los principales métodos experimentales utilizados en lipidómica se basan en espectrometría de masas (SM) junto con diversas técnicas de cromatografía y movilidad iónica 7,8. El uso de MS en el área es ventajoso debido a su alta especificidad y sensibilidad, velocidad de adquisición y capacidades únicas para (1) detectar lípidos y metabolitos de lípidos que ocurren incluso a niveles bajos y transitorios, (2) detectar cientos de compuestos lipídicos diferentes en un solo experimento, (3) identificar lípidos previamente desconocidos y (4) distinguir entre isómeros lipídicos. Entre los desarrollos en EM, incluyendo la ionización por electrospray de desorción (DESI), MALDI y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), MALDI MSI ha surgido como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales basados en EM al proporcionar información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares 9,10.
El flujo de trabajo típico de la lipidómica consiste en la preparación de muestras, la adquisición de datos mediante tecnología de espectrometría de masas y el análisis de datos11. El estudio de lípidos y metabolitos en muestras ha llevado a la aparición de técnicas para comprender las condiciones fisiológicas y patológicas de los procesos metabólicos en los organismos. Si bien la comprensión de las interacciones biológicas es importante, la sensibilidad de los lípidos y metabolitos hace que sean difíciles de visualizar e identificar sin colorantes u otras modificaciones. Los cambios en los niveles o distribución de metabolitos pueden conducir a cambios fenotípicos. Una herramienta utilizada para el perfil metabolómico es MALDI MSI, una técnica de imagen in situ sin etiquetas capaz de detectar cientos de moléculas simultáneamente. Las imágenes MALDI permiten la visualización de metabolitos y lípidos en muestras al tiempo que preservan su integridad y distribución espacial. La tecnología anterior para el perfil de lípidos implicaba el uso de productos químicos radiactivos para mapear individualmente los lípidos, mientras que las imágenes MALDI renuncian a esto y permiten la detección de una variedad de lípidos simultáneamente.
El metabolismo de los lípidos y la homeostasis desempeñan funciones importantes en la fisiología celular, como el mantenimiento y desarrollo del sistema nervioso. Un aspecto esencial del metabolismo lipídico del sistema nervioso es el desplazamiento de lípidos entre las neuronas y las células gliales, que está mediado por lipoproteínas transportadoras moleculares, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL)12. Las lipoproteínas contienen apolipoproteínas (Apo), como ApoB y ApoD, que funcionan como bloques estructurales de carga lipídica y como ligandos para los receptores de lipoproteínas. La diafonía neurona-glía de lípidos involucra a múltiples jugadores como ApoD, ApoE y ApoJ derivados de la glía, y sus receptores neuronales de LDL (LDLR)13,14. En Drosophila, la apolipoforina, un miembro de la familia ApoB, es un importante portador de lípidos hemolinfáticos15. La apolipoforina tiene dos receptores de lipoforina estrechamente relacionados (LpRs), LpR1 y LpR2, que son homólogos de LDLR15,16 en mamíferos. En estudios previos, se descubrió que la lipocalina secretada por astrocitos Glial Lazarillo (GLaz), un homólogo de Drosophila de la ApoD humana, y su receptor neuronal LpR1 median cooperativamente el transporte de lípidos neurona-glia, regulando así la morfogénesis de las dendritas17. Por lo tanto, se especuló que la pérdida de LpR1 causaría una disminución en el contenido total de lípidos en el cerebro de Drosophila. MALDI MSI sería una herramienta adecuada para perfilar el contenido de lípidos en pequeños tejidos de cerebros mutantes y de Drosophila mutantes y salvajes de LpR1−/−, como se demuestra en este estudio.
A pesar de la creciente popularidad de MALDI MSI, el alto costo del instrumento y la complejidad experimental a menudo impiden su implementación en laboratorios individuales. Por lo tanto, la mayoría de los estudios MALDI MSI se realizan utilizando instalaciones centrales compartidas. Al igual que con otras aplicaciones de MALDI MSI, un proceso cuidadoso de preparación de muestras para lipidómica es fundamental para lograr resultados confiables. Sin embargo, debido a que la preparación de la muestra de portaobjetos se realiza típicamente en laboratorios de investigación individuales, existe la posibilidad de variación en la adquisición de MALDI MSI. Para combatir esto, este artículo tiene como objetivo proporcionar un protocolo detallado para la preparación de muestras biológicas pequeñas antes de la medición de MALDI MSI utilizando el análisis lipídico de un gran grupo de cerebros adultos de Drosophila en modo de iones positivos como ejemplo11,17. Sin embargo, algunas clases de fosfolípidos y la mayoría de los metabolitos pequeños se detectan favorablemente mediante imágenes MALDI en modo de iones negativos, que se describió anteriormente11. Por lo tanto, con estos dos estudios de ejemplo, esperamos proporcionar protocolos detallados de preparación de muestras de varias combinaciones: tejido grande independiente versus tejido pequeño incrustado, montaje de descongelación versus montaje de diapositiva caliente y modo de iones positivos versus modo de iones negativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se demostró en el estudio sobre las variaciones en la composición de lípidos en cerebros mutantes y salvajes de Drosophila, MALDI MSI puede ser una valiosa técnica de imagen sin etiqueta para el análisis in situ de patrones de distribución molecular dentro de órganos de pequeños insectos. De hecho, debido a que los lípidos se distribuyen tanto en el tejido cerebral como en los cuerpos grasos de las cabezas de Drosophila, los enfoques lipidómicos convencionales basados en cromatog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy y Mayan Hein cuentan con el apoyo del Programa de Investigación de Verano de CUNY (CSURP) de la Fundación Sloan. Jun Yin cuenta con el apoyo del programa de investigación intramuros del Proyecto de los Institutos Nacionales de Salud Número 1ZIANS003137. El apoyo para este proyecto fue proporcionado por un Premio PSC-CUNY a Ye He y Rinat Abzalimov, financiado conjuntamente por el Congreso de Personal Profesional y la Universidad de la Ciudad de Nueva York.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
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