Подготовка образцов для быстрого анализа липидов в мозге дрозофилы с использованием матричной лазерной десорбции / ионизационной масс-спектрометрии
Summary
Целью этого протокола является предоставление подробных рекомендаций по надлежащей подготовке образцов для анализа липидов и метаболитов в небольших тканях, таких как мозг дрозофилы , с использованием масс-спектрометрии с помощью матрицы лазерной десорбции / ионизации (MALDI).
Abstract
Липидное профилирование, или липидомика, является хорошо зарекомендовавшим себя методом, используемым для изучения всего содержания липидов в клетке или ткани. Информация, полученная от липидомики, ценна при изучении путей, участвующих в развитии, болезни и клеточном метаболизме. Многие инструменты и приборы помогли проектам липидомики, в первую очередь различные комбинации методов масс-спектрометрии и жидкостной хроматографии. Матричная лазерная десорбция / ионизация масс-спектрометрии (MALDI MSI) недавно стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы. Этот новый метод предоставляет уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах, которое ранее было недостижимо без использования чрезмерных модификаций. Выборочная подготовка подхода MALDI MSI имеет решающее значение и, следовательно, находится в центре внимания настоящего документа. В этой статье представлен быстрый липидный анализ большого количества мозгов дрозофилы , встроенных в соединение оптимальной температуры резания (OCT), чтобы обеспечить подробный протокол подготовки мелких тканей к анализу липидов или метаболитному и мелкомолекулярному анализу с помощью MALDI MSI.
Introduction
Липиды участвуют в широком спектре биологических процессов и могут быть широко классифицированы на пять категорий на основе их структурного разнообразия: жирные кислоты, триацилглицерины (TAGs), фосфолипиды, липиды стеринов и сфинголипиды1. Фундаментальные функции липидов заключаются в обеспечении источников энергии для биологических процессов (т.е. TAGs) и образовании клеточных мембран (т.е. фосфолипидов и холестерина). Тем не менее, дополнительные роли липидов были отмечены в развитии и заболеваниях и были широко изучены в биомедицинской области. Например, отчеты показали, что жирные кислоты разной длины могут играть уникальную терапевтическую роль. Короткие цепи жирных кислот могут быть вовлечены в защитные механизмы против аутоиммунных заболеваний, цепи жирных кислот средней длины производят метаболиты, которые могут смягчать судороги, а длинные цепи жирных кислот генерируют метаболиты, которые могут быть использованы для лечения метаболических нарушений2. В нервной системе было показано, что холестерин и фосфолипиды, полученные из глии, жизненно важны для синаптогенеза 3,4. Другие типы липидов показали многообещающие результаты в медицинских применениях, включая сфинголипиды, используемые в системах доставки лекарств, и сахаролипиды, используемые для поддержки иммунной системы 5,6. Многочисленные роли и потенциальные терапевтические применения липидов в биомедицинской области сделали липидомику — изучение путей и взаимодействий клеточных липидов — критической и все более важной областью.
Липидомика использует аналитическую химию для изучения липидома в больших масштабах. Основные экспериментальные методы, используемые в липидомике, основаны на масс-спектрометрии (МС) в сочетании с различными методами хроматографии и ионной подвижности 7,8. Использование РС в этой области выгодно из-за его высокой специфичности и чувствительности, скорости приобретения и уникальных возможностей для (1) обнаружения липидов и липидных метаболитов, встречающихся даже на низких и переходных уровнях, (2) обнаружения сотен различных липидных соединений в одном эксперименте, (3) выявления ранее неизвестных липидов и (4) различения липидных изомеров. Среди разработок в области РС, включая десорбционную электрораспылительную ионизацию (DESI), MALDI и масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS), MALDI MSI стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы на основе MS, предоставляя уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах 9,10.
Типичный рабочий процесс липидомики состоит из пробоподготовки, сбора данных с использованием технологии масс-спектрометрии и анализа данных11. Изучение липидов и метаболитов в образцах привело к появлению методик по пониманию физиологических и патологических состояний обменных процессов в организмах. Хотя понимание биологических взаимодействий важно, чувствительность липидов и метаболитов затрудняет их изображение и идентификацию без красителей или других модификаций. Изменения в уровнях или распределении метаболитов могут привести к фенотипическим изменениям. Одним из инструментов, используемых для метаболомического профилирования, является MALDI MSI, метод визуализации in situ без меток, способный обнаруживать сотни молекул одновременно. Визуализация MALDI позволяет визуализировать метаболиты и липиды в образцах, сохраняя при этом их целостность и пространственное распределение. Предыдущая технология профилирования липидов включала использование радиоактивных химических веществ для индивидуального картирования липидов, в то время как визуализация MALDI отказывается от этого и позволяет одновременно обнаруживать ряд липидов.
Липидный обмен и гомеостаз играют важную роль в физиологии клеток, таких как поддержание и развитие нервной системы. Одним из существенных аспектов липидного обмена нервной системы является перемещение липидов между нейронами и глиальными клетками, которое опосредовано молекулярными липопротеинами-носителями, включая липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП)12. Липопротеины содержат аполипопротеины (Апо), такие как ApoB и ApoD, которые функционируют как структурные блоки липидного груза и как лиганды для липопротеиновых рецепторов. Перекрестные помехи липидов нейрон-глия включают в себя несколько игроков, таких как ApoD, ApoE и ApoJ, полученные из глии, и их нейронные рецепторы ЛПНП (LDLRs)13,14. У дрозофилы аполипофорин, член семейства ApoB, является основным носителем липидов гемолимфы15. Аполипофорин имеет два тесно связанных липофориновых рецептора (LpR), LpR1 и LpR2, которые являются гомологами LDLR15,16 млекопитающих. В предыдущих исследованиях было обнаружено, что астроцитарно-секретируемый липокалин Glial Lazarillo (GLaz), гомолог дрозофилы человеческого ApoD, и его нейрональный рецептор LpR1 совместно опосредуют липидный шаттлинг нейрон-глия, тем самым регулируя морфогенез дендрита17. Поэтому было высказано предположение, что потеря LpR1 вызовет снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы. MALDI MSI будет подходящим инструментом для профилирования липидного содержимого в небольших тканях мозга дрозофилы LpR1−/−, как показано в этом исследовании.
Несмотря на растущую популярность MALDI MSI, высокая стоимость и экспериментальная сложность прибора часто препятствуют его внедрению в отдельных лабораториях. Таким образом, большинство исследований MALDI MSI проводятся с использованием общих основных средств. Как и в случае с другими применениями MALDI MSI, тщательный процесс подготовки образцов для липидомики имеет решающее значение для достижения надежных результатов. Однако, поскольку подготовка образцовых слайдов обычно выполняется в отдельных исследовательских лабораториях, существует вероятность вариаций в приобретении MALDI MSI. Чтобы бороться с этим, эта статья направлена на предоставление подробного протокола для пробоподготовки небольших биологических образцов до измерения MALDI MSI с использованием анализа липидов большой группы взрослых мозгов дрозофилы в режиме положительных ионов в качестве примера11,17. Однако некоторые классы фосфолипидов и большинство мелких метаболитов благоприятно обнаруживаются с помощью визуализации MALDI в режиме отрицательных ионов, который был описан ранее11. Таким образом, с помощью этих двух примеров исследований мы надеемся предоставить подробные протоколы пробоподготовки различных комбинаций: отдельно стоящая большая ткань против встроенной мелкой ткани, оттаивание по сравнению с установкой с теплым скольжением и режим положительных ионов против режима отрицательных ионов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как было продемонстрировано в исследовании вариаций липидного состава в мозге дрозофилы мутантного и дикого типа, MALDI MSI может быть ценным методом визуализации без меток для анализа in situ молекулярных моделей распределения в органах мелких насекомых. Действительно, поскольку …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy и Mayan Hein поддерживаются Летней исследовательской программой CUNY (CSURP) Фонда Слоуна. Цзюнь Инь поддерживается программой внутренних исследований Проекта Национальных институтов здравоохранения No 1ZIANS003137. Поддержку этому проекту оказала премия PSC-CUNY Е Хе и Рината Абзалимова, совместно финансируемая Конгрессом профессиональных сотрудников и Городским университетом Нью-Йорка.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
