Prøveforberedelse til hurtig lipidanalyse i Drosophila-hjernen ved hjælp af matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse
Summary
Formålet med denne protokol er at give detaljeret vejledning om korrekt prøveforberedelse til lipid- og metabolitanalyse i små væv, såsom Drosophila-hjernen , ved hjælp af matrixassisteret laserdesorption / ionisering (MALDI) massespektrometribilleddannelse.
Abstract
Lipidprofilering eller lipidomics er en veletableret teknik, der bruges til at studere hele lipidindholdet i en celle eller et væv. Oplysninger erhvervet fra lipidomics er værdifulde i studiet af de veje, der er involveret i udvikling, sygdom og cellulær metabolisme. Mange værktøjer og instrumenter har hjulpet lipidomics projekter, især forskellige kombinationer af massespektrometri og væskekromatografi teknikker. Matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse (MALDI MSI) er for nylig opstået som en kraftfuld billeddannelsesteknik, der supplerer konventionelle tilgange. Denne nye teknik giver unik information om den rumlige fordeling af lipider i vævsrum, som tidligere var uopnåelig uden brug af overdrevne modifikationer. Prøveforberedelsen af MALDI MSI-tilgangen er kritisk og er derfor fokus for dette papir. Dette papir præsenterer en hurtig lipidanalyse af et stort antal Drosophila-hjerner indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) for at give en detaljeret protokol til fremstilling af små væv til lipidanalyse eller metabolit og analyse af små molekyler gennem MALDI MSI.
Introduction
Lipider er involveret i en bred vifte af biologiske processer og kan bredt klassificeres i fem kategorier baseret på deres strukturelle mangfoldighed: fedtsyrer, triacylglyceroler (TAGs), fosfolipider, sterollipider og sphingolipider1. Lipidernes grundlæggende funktioner er at tilvejebringe energikilder til biologiske processer (dvs. TAGs) og danne cellulære membraner (dvs. fosfolipider og kolesterol). Imidlertid er yderligere roller af lipider blevet noteret i udvikling og sygdomme og er blevet grundigt undersøgt på det biomedicinske område. For eksempel har rapporter vist, at fedtsyrer af forskellig længde kan have unikke terapeutiske roller. Korte fedtsyrekæder kan være involveret i forsvarsmekanismer mod autoimmune sygdomme, mellemlange fedtsyrekæder producerer metabolitter, der kan afbøde anfald, og lange fedtsyrekæder genererer metabolitter, der kan bruges til behandling af metaboliske lidelser2. I nervesystemet har glia-afledt kolesterol og fosfolipider vist sig at være afgørende for synaptogenese 3,4. Andre typer af lipider har vist løfte i medicinske applikationer, herunder sphingolipider anvendes i lægemiddelafgivelsessystemer og saccharolipider, der anvendes til at understøtte immunsystemet 5,6. De mange roller og potentielle terapeutiske anvendelser af lipider på det biomedicinske område har gjort lipidomics – undersøgelsen af veje og interaktioner mellem cellulære lipider – et kritisk og stadig vigtigere felt.
Lipidomics gør brug af analytisk kemi til at studere lipidomet i stor skala. De vigtigste eksperimentelle metoder, der anvendes i lipidomics, er baseret på massespektrometri (MS) kombineret med forskellige kromatografi- og ionmobilitetsteknikker 7,8. Brugen af MS i området er fordelagtig på grund af dets høje specificitet og følsomhed, erhvervelseshastighed og unikke evner til (1) at detektere lipider og lipidmetabolitter, der forekommer selv ved lave og forbigående niveauer, (2) detektere hundredvis af forskellige lipidforbindelser i et enkelt eksperiment, (3) identificere tidligere ukendte lipider og (4) skelne mellem lipidisomerer. Blandt udviklingen inden for MS, herunder desorptionselektrosprayionisering (DESI), MALDI og sekundær ionmassespektrometri (SIMS), har MALDI MSI vist sig som en kraftfuld billeddannelsesteknik, der supplerer konventionelle MS-baserede tilgange ved at give unik information om den rumlige fordeling af lipider i vævsrum 9,10.
Den typiske arbejdsgang for lipidomics består af prøveforberedelse, dataindsamling ved hjælp af massespektrometriteknologi og dataanalyse11. Undersøgelsen af lipider og metabolitter i prøver har ført til fremkomsten af teknikker til at forstå de fysiologiske og patologiske tilstande af metaboliske processer i organismer. Mens forståelse af biologiske interaktioner er vigtig, gør følsomheden af lipider og metabolitter dem vanskelige at afbilde og identificere uden farvestoffer eller anden modifikation. Ændringer i metabolitniveauer eller fordeling kan føre til fænotypiske ændringer. Et værktøj, der bruges til metabolomisk profilering, er MALDI MSI, en etiketfri, in situ-billeddannelsesteknik , der er i stand til at detektere hundredvis af molekyler samtidigt. MALDI-billeddannelse giver mulighed for visualisering af metabolitter og lipider i prøver, samtidig med at deres integritet og rumlige fordeling bevares. Tidligere teknologi til lipidprofilering involverede brugen af radioaktive kemikalier til individuelt at kortlægge lipider, mens MALDI-billeddannelse giver afkald på dette og giver mulighed for påvisning af en række lipider samtidigt.
Lipidmetabolisme og homeostase spiller vigtige funktioner i cellefysiologi, såsom vedligeholdelse og udvikling af nervesystemet. Et væsentligt aspekt af nervesystemets lipidmetabolisme er lipidkredsløbet mellem neuroner og gliaceller, som medieres af molekylære bærerlipoproteiner, herunder lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med lav densitet (LDL) og lipoproteiner med høj densitet (HDL)12. Lipoproteiner indeholder apolipoproteiner (Apo), såsom ApoB og ApoD, der fungerer som strukturelle blokke af lipidlast og som ligander til lipoproteinreceptorer. Neuron-glia crosstalk af lipider involverer flere spillere såsom glia-afledt ApoD, ApoE og ApoJ og deres neuronale LDL-receptorer (LDLR’er)13,14. I Drosophila er apolipophorin, et medlem af ApoB-familien, en stor hæmolymph lipidbærer15. Apolipophorin har to nært beslægtede lipophorinreceptorer (LpR’er), LpR1 og LpR2, som er homologer af pattedyr LDLR 15,16. I tidligere undersøgelser blev den astrocytudskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog af human ApoD, og dens neuronale receptor LpR1 opdaget til kooperativt at formidle neuron-glia lipid shuttling og dermed regulere dendritmorfogenese17. Derfor blev det spekuleret i, at tabet af LpR1 ville medføre et fald i det samlede lipidindhold i Drosophila-hjernen. MALDI MSI ville være et passende værktøj til profilering af lipidindholdet i små væv af LpR1-/- mutante og vildtype Drosophila-hjerner, som demonstreret i denne undersøgelse.
På trods af MALDI MSI’s voksende popularitet hæmmer instrumentets høje omkostninger og eksperimentelle kompleksitet ofte dets implementering i individuelle laboratorier. Således udføres de fleste MALDI MSI-undersøgelser ved hjælp af delte kernefaciliteter. Som med andre anvendelser af MALDI MSI er en omhyggelig prøveforberedelsesproces for lipidomics afgørende for at opnå pålidelige resultater. Men fordi prøvediasforberedelse typisk udføres i individuelle forskningslaboratorier, er der mulighed for variation i MALDI MSI-erhvervelse. For at bekæmpe dette har dette papir til formål at give en detaljeret protokol til prøveforberedelse af små biologiske prøver forud for MALDI MSI-måling ved hjælp af lipidanalyse af en stor gruppe voksne Drosophila-hjerner i positiv iontilstand som et eksempel11,17. Imidlertid påvises nogle fosfolipidklasser og størstedelen af små metabolitter positivt ved MALDI-billeddannelse i negativ iontilstand, som tidligere er beskrevet11. Derfor håber vi med disse to eksempelstudier at give detaljerede prøveforberedelsesprotokoller for forskellige kombinationer: fritstående stort væv versus indlejret lille væv, optøningsmontering versus varmglasmontering og positiv iontilstand versus negativ iontilstand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som demonstreret i undersøgelsen af variationerne i lipidsammensætning i mutante og vildtype Drosophila-hjerner kan MALDI MSI være en værdifuld etiketfri billeddannelsesteknik til in situ-analyse af molekylære distributionsmønstre i organer af små insekter. Faktisk, fordi lipider er fordelt i både hjernevæv og fedtlegemer af Drosophila-hoveder, kan konventionelle lipidomics-tilgange baseret på væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS) kun detektere kombinerede signaler fra begge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy og Maya Hein støttes af Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin understøttes af det intramurale forskningsprogram fra National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Støtte til dette projekt blev ydet af en PSC-CUNY Award til Ye He og Rinat Abzalimov, finansieret i fællesskab af The Professional Staff Congress og The City University of New York.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
