Prøvepreparering for rask lipidanalyse i Drosophila Brain ved bruk av matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering massespektrometriavbildning
Summary
Målet med denne protokollen er å gi detaljert veiledning om riktig prøvepreparering for lipid- og metabolittanalyse i små vev, slik som Drosophila-hjernen , ved bruk av matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) massespektrometriavbildning.
Abstract
Lipidprofilering, eller lipidomikk, er en veletablert teknikk som brukes til å studere hele lipidinnholdet i en celle eller et vev. Informasjon ervervet fra lipidomikk er verdifull for å studere veiene som er involvert i utvikling, sykdom og cellulær metabolisme. Mange verktøy og instrumenteringer har hjulpet lipidomikkprosjekter, særlig ulike kombinasjoner av massespektrometri og væskekromatografiteknikker. Matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering massespektrometriavbildning (MALDI MSI) har nylig dukket opp som en kraftig bildebehandlingsteknikk som utfyller konvensjonelle tilnærminger. Denne nye teknikken gir unik informasjon om den romlige fordelingen av lipider i vevsrom, som tidligere var uoppnåelig uten bruk av overdreven modifikasjoner. Prøveprepareringen av MALDI MSI-tilnærmingen er kritisk og er derfor fokus for denne artikkelen. Dette papiret presenterer en rask lipidanalyse av et stort antall Drosophila-hjerner innebygd i optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) for å gi en detaljert protokoll for fremstilling av små vev for lipidanalyse eller metabolitt- og småmolekylanalyse gjennom MALDI MSI.
Introduction
Lipider er involvert i et bredt spekter av biologiske prosesser og kan grovt klassifiseres i fem kategorier basert på deres strukturelle mangfold: fettsyrer, triacylglyceroler (TAGs), fosfolipider, sterollipider og sfingolipider1. De grunnleggende funksjonene til lipider er å gi energikilder for biologiske prosesser (dvs. TAGs) og danne cellulære membraner (dvs. fosfolipider og kolesterol). Imidlertid har flere roller av lipider blitt notert i utvikling og sykdommer, og har blitt grundig studert i det biomedisinske feltet. For eksempel har rapporter vist at fettsyrer av forskjellig lengde kan ha unike terapeutiske roller. Korte fettsyrekjeder kan være involvert i forsvarsmekanismer mot autoimmune sykdommer, mellomlange fettsyrekjeder produserer metabolitter som kan redusere anfall, og lange fettsyrekjeder genererer metabolitter som kan brukes til å behandle metabolske forstyrrelser2. I nervesystemet har glia-avledet kolesterol og fosfolipider vist seg å være avgjørende for synaptogenese 3,4. Andre typer lipider har vist løfte i medisinske applikasjoner, inkludert sfingolipider som brukes i legemiddelleveringssystemer og sakkarolipider som brukes til å støtte immunsystemet 5,6. De mange rollene og potensielle terapeutiske anvendelser av lipider i det biomedisinske feltet har gjort lipidomikk – studiet av veier og interaksjoner av cellulære lipider – et kritisk og stadig viktigere felt.
Lipidomics bruker analytisk kjemi for å studere lipidomet i stor skala. De viktigste eksperimentelle metodene som brukes i lipidomikk er basert på massespektrometri (MS) kombinert med ulike kromatografi- og ionmobilitetsteknikker 7,8. Bruken av MS i området er fordelaktig på grunn av sin høye spesifisitet og følsomhet, anskaffelseshastighet og unike evner til å (1) oppdage lipider og lipidmetabolitter som forekommer selv ved lave og forbigående nivåer, (2) oppdage hundrevis av forskjellige lipidforbindelser i et enkelt eksperiment, (3) identifisere tidligere ukjente lipider, og (4) skille mellom lipidisomerer. Blant utviklingen innen MS, inkludert desorpsjonselektrosprayionisering (DESI), MALDI og sekundær ionmassespektrometri (SIMS), MALDI MSI har dukket opp som en kraftig avbildningsteknikk som utfyller konvensjonelle MS-baserte tilnærminger ved å gi unik informasjon om romlig fordeling av lipider i vevsrom 9,10.
Den typiske arbeidsflyten for lipidomikk består av prøvepreparering, datainnsamling ved hjelp av massespektrometriteknologi og dataanalyse11. Studien av lipider og metabolitter i prøver har ført til fremveksten av teknikker for å forstå de fysiologiske og patologiske forholdene i metabolske prosesser i organismer. Selv om det er viktig å forstå biologiske interaksjoner, gjør følsomheten til lipider og metabolitter dem vanskelige å avbilde og identifisere uten fargestoffer eller annen modifikasjon. Endringer i metabolittnivåer eller distribusjon kan føre til fenotypiske endringer. Et verktøy som brukes til metabolomisk profilering er MALDI MSI, en etikettfri, in situ avbildningsteknikk som er i stand til å oppdage hundrevis av molekyler samtidig. MALDI-avbildning muliggjør visualisering av metabolitter og lipider i prøver samtidig som de opprettholder deres integritet og romlige fordeling. Tidligere teknologi for lipidprofilering involverte bruk av radioaktive kjemikalier for å kartlegge lipider individuelt, mens MALDI-avbildning gir avkall på dette og muliggjør påvisning av en rekke lipider samtidig.
Lipidmetabolisme og homeostase spiller viktige funksjoner i cellefysiologi, for eksempel vedlikehold og utvikling av nervesystemet. Et viktig aspekt av nervesystemets lipidmetabolisme er lipidshuttlingen mellom nevroner og gliaceller, som er mediert av molekylære bærerlipoproteiner, inkludert svært lavt tetthet lipoprotein (VLDL), lavdensitetslipoproteiner (LDL) og høy tetthet lipoproteiner (HDL) 12. Lipoproteiner inneholder apolipoproteiner (Apo), som ApoB og ApoD, som fungerer som strukturelle blokker av lipidlast og som ligander for lipoproteinreseptorer. Neuron-glia crosstalk av lipider involverer flere spillere som glia-avledet ApoD, ApoE og ApoJ, og deres neuronale LDL-reseptorer (LDLR)13,14. I Drosophila er apolipophorin, medlem av ApoB-familien, en stor hemolymph lipidbærer15. Apolipophorin har to nært beslektede lipoforinreseptorer (LpRs), LpR1 og LpR2, som er homologer av pattedyr LDLR15,16. I tidligere studier ble det astrocyttutskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av human ApoD, og dets nevronreseptor LpR1 oppdaget å kooperativt mediere neuron-glia lipid shuttling, og dermed regulere dendritmorfogenese17. Derfor ble det spekulert i at tapet av LpR1 ville føre til en reduksjon i det totale lipidinnholdet i Drosophila-hjernen. MALDI MSI vil være et egnet verktøy for å profilere lipidinnholdet i små vev av LpR1–/− mutante og villtype Drosophila-hjerner, som vist i denne studien.
Til tross for den økende populariteten til MALDI MSI, hindrer instrumentets høye kostnader og eksperimentelle kompleksitet ofte implementeringen i individuelle laboratorier. Dermed utføres de fleste MALDI MSI-studier ved hjelp av delte kjernefasiliteter. Som med andre anvendelser av MALDI MSI, er en forsiktig prøveprepareringsprosess for lipidomikk avgjørende for å oppnå pålitelige resultater. Men fordi prøvelysning vanligvis utføres i individuelle forskningslaboratorier, er det en mulighet for variasjon i MALDI MSI-oppkjøp. For å bekjempe dette, tar dette papiret sikte på å gi en detaljert protokoll for prøvepreparering av små biologiske prøver før MALDI MSI-måling ved hjelp av lipidanalyse av en stor gruppe voksne Drosophila-hjerner i positiv ionmodus som et eksempel11,17. Imidlertid er noen fosfolipidklasser og flertallet av små metabolitter gunstig detektert ved MALDI-avbildning i negativ ionmodus, som ble beskrevet tidligere11. Derfor, med disse to eksempelstudiene, håper vi å gi detaljerte prøveprepareringsprotokoller av forskjellige kombinasjoner: frittstående stort vev versus innebygd lite vev, tinemontering versus varmskyvmontering og positiv ionmodus versus negativ ionmodus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som vist i studien om variasjonene i lipidsammensetningen i mutante og villtype Drosophila-hjerner, kan MALDI MSI være en verdifull etikettfri avbildningsteknikk for in situ-analyse av molekylære distribusjonsmønstre i organer av små insekter. Faktisk, fordi lipider fordeles i både hjernevev og fettlegemer i Drosophila-hoder, kan konvensjonelle lipidomikktilnærminger basert på væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS) bare oppdage kombinerte signaler fra begge regioner når helhode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy og Mayan Hein støttes av Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin støttes av det intramurale forskningsprogrammet til National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Støtte til dette prosjektet ble gitt av en PSC-CUNY Award til Ye He og Rinat Abzalimov, finansiert av The Professional Staff Congress og The City University of New York.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
