Multi-Stream-Perfusionsbioreaktor integriert mit Auslassfraktionierung für dynamische Zellkultur

Summary

Dieses Papier stellt eine Methode zum Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen, mehrkanaligen Perfusionszellkultursystems zur Messung der Dynamik der Sekretions- und Absorptionsraten von gelösten Stoffen in zellulären Prozessen vor. Das System kann Zellen auch dynamischen Reizprofilen aussetzen.

Abstract

Bestimmte Zell- und Gewebefunktionen arbeiten innerhalb der dynamischen Zeitskala von Minuten bis Stunden, die von herkömmlichen Kultursystemen schlecht aufgelöst werden. Diese Arbeit hat ein kostengünstiges Perfusionsbioreaktorsystem entwickelt, mit dem Kulturmedium kontinuierlich in ein Zellkulturmodul perfundiert und in einem nachgeschalteten Modul fraktioniert werden kann, um die Dynamik auf dieser Skala zu messen. Das System besteht fast ausschließlich aus kommerziell erhältlichen Teilen und kann parallelisiert werden, um unabhängige Experimente in herkömmlichen Multi-Well-Zellkulturplatten gleichzeitig durchzuführen. Dieser Videoartikel zeigt, wie Sie das Basis-Setup zusammenbauen, das nur eine einzige Mehrkanal-Spritzenpumpe und einen modifizierten Fraktionskollektor benötigt, um bis zu sechs Kulturen parallel zu perfusionieren. Es werden auch nützliche Varianten des modularen Aufbaus vorgestellt, die eine kontrollierte Stimulationsdynamik ermöglichen, wie z.B. gelöste Impulse oder pharmakokinetische Profile. Wichtig ist, dass die Signale des gelösten Stoffes, wenn sie durch das System wandern, aufgrund der Dispersion des gelösten Stoffes verzerrt sind. Weiterhin wird ein Verfahren zur Messung der Verweilzeitverteilungen (RTDs) der Komponenten des Perfusionsaufbaus mit einem Tracer unter Verwendung von MATLAB beschrieben. RTDs sind nützlich, um zu berechnen, wie gelöste Signale durch den Durchfluss im Multikompartimentsystem verzerrt werden. Dieses System ist sehr robust und reproduzierbar, so dass Grundlagenforscher es leicht übernehmen können, ohne dass spezielle Fertigungsanlagen erforderlich sind.

Introduction

Viele wichtige biologische Prozesse laufen in Zell- und Gewebekulturen auf der Zeitskala von Minuten bis Stunden^ab 1,2,3. Während einige dieser Phänomene automatisiert mit Zeitraffermikroskopie⁴, Biolumineszenz¹ oder anderen Methoden beobachtet und aufgezeichnet werden können, werden Experimente mit der Sammlung von Kulturüberstandsproben für die chemische Analyse häufig manuell in statischen Zellkulturen durchgeführt. Die manuelle Probenahme schränkt die Durchführbarkeit bestimmter Studien ein, da häufige oder außerbörsliche Probenahmezeitpunkte unbequem sind. Zu den weiteren Mängeln statischer Kulturmethoden gehören Experimente mit kontrollierten, vorübergehenden Expositionen gegenüber chemischen Reizen. In statischen Kulturen müssen Reize manuell hinzugefügt und entfernt werden, und Reizprofile sind auf Schrittänderungen im Laufe der Zeit beschränkt, während mittlere Änderungen auch andere Mediumskomponenten hinzufügen und entfernen, die Zellen auf unkontrollierte Weise beeinflussen können⁵. Fluidische Systeme können diese Herausforderungen meistern, aber bestehende Geräte stellen andere Herausforderungen dar. Mikrofluidische Geräte sind mit den unerschwinglichen Kosten für spezielle Ausrüstung und Schulungen zur Herstellung und Verwendung verbunden, erfordern mikroanalytische Methoden zur Verarbeitung von Proben und Zellen sind nach der Perfusion schwer aus den Geräten zu gewinnen⁶. Nur wenige makrofluidische Systeme wurden für die hier beschriebenen Arten von Experimenten entwickelt ^7,8,9,10, und sie bestehen aus mehreren kundenspezifischen Teilen, die im eigenen Haus hergestellt werden und mehrere Pumpen oder Fraktionskollektoren erfordern. Darüber hinaus sind den Autoren keine kommerziell erhältlichen makrofluidischen Perfusionszellkultursysteme außer Rührkesselbioreaktoren für die Suspensionskultur bekannt, die für die Bioproduktion nützlich sind, jedoch nicht für die Modellierung und das Studium der Physiologie ausgelegt sind.

Die Autoren berichteten zuvor über das Design eines kostengünstigen Perfusionsbioreaktorsystems, das fast ausschließlich aus kommerziell erhältlichen Teilen¹¹ besteht. Die Basisversion des Systems ermöglicht es, mehrere Kulturen in einer Bohrlochplatte in einem CO 2-Inkubator zu halten und kontinuierlich mit Medium aus einer Spritzenpumpe zu perfundieren, während die Abwassermittelströme aus den Kulturen im Laufe der Zeit automatisch zu Proben fraktioniert werden, wobei ein Fraktionskollektor mit einer kundenspezifischen Modifikation verwendet wird. Somit ermöglicht dieses System eine automatisierte Probenahme von Kulturmediumüberständen und kontinuierlichen gelösten Stoffen in die Kulturen im Laufe der Zeit. Das System ist makrofluidisch und modular aufgebaut und kann leicht modifiziert werden, um die Anforderungen neuartiger Versuchsdesigns zu erfüllen.

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methode ist es, ein Perfusionszellkultursystem zu konstruieren, zu charakterisieren und zu verwenden, das Experimente ermöglicht, bei denen die Sekretions- oder Absorptionsraten von Substanzen durch Zellen im Laufe der Zeit gemessen werden und/oder Zellen präzisen, transienten gelösten Signalen ausgesetzt werden. Dieser Videoartikel erklärt, wie Sie das Basis-Setup zusammenbauen, das in der Lage ist, bis zu sechs Zellkulturen gleichzeitig mit einer einzigen Spritzenpumpe und einem modifizierten Fraktionssammler zu durchbluten. Zwei nützliche Varianten des Basissystems, die zusätzliche Pumpen und Teile verwenden, um Experimente zu ermöglichen, die Zellen transienten Konzentrationssignalen für gelöste Stoffe aussetzen, einschließlich kurzer Pulse und pharmakokinetischer ähnlicher Profile¹², werden ebenfalls vorgestellt, wie in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Drei Variationen des Perfusionssystemdesigns. (Top) Das grundlegende Perfusionssystem. (Mitte) Das Perfusionssystem mit einem Absperrhahn für mehrere mittlere Quellen. (Unten) Das Perfusionssystem mit einem gerührten Tank, um ein gut gemischtes Verteilungsvolumen nachzuahmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Aufgrund der Dispersion und Diffusion innerhalb der Strömung werden die gelösten Signale verzerrt oder “verschmiert”, wenn sie durch das Strömungssystem wandern. Diese Verzerrung kann durch die Verwendung von Verweilzeitverteilungen (RTDs)¹³ quantifiziert werden. In diesem Artikel wird erläutert, wie Tracer-Experimente an Komponenten des Perfusionssystems durchgeführt werden (Abbildung 2), und es werden MATLAB-Skripte zum Generieren von RTDs aus Messdaten bereitgestellt. Eine detaillierte Erläuterung dieser Analyse findet sich im vorherigen Paper¹¹ der Autoren. Zusätzliche MATLAB-Skripte passen die entsprechenden Funktionen an die RTDs an, extrahieren physikalische Parameter und führen eine Signalfaltung mithilfe von RTDs durch, um vorherzusagen, wie sich der Benutzer durch das Perfusionssystem ausbreitet und verzerrt¹⁴.

Abbildung 2: Verweilzeitverteilungen. Die RTDs von Strömungssystemkomponenten, wie diese Länge der Röhren, werden gemessen, indem ein Impuls des Tracers in das System eingegeben wird und gemessen wird, wie er “schmiert”, wenn er in die gesammelten Fraktionen austritt. Diese Figur wurde von Erickson et ^al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

1. Bereiten Sie Teile für die Durchblutung der Bohrlochplatte vor Schläuche vorbereiten Schneiden Sie zwei Längen Silikonschläuche (1,6 mm Innendurchmesser) für jede zu durchblutende Zellkultur. Stellen Sie sicher, dass das Stück, das als vorgeschalteter Schlauch verwendet wird, lang genug ist, um von der Spritzenpumpe bis zur Zellkultur im Inkubator zu reichen, und dass das nachgeschaltete Stück von der Zellkultur bis zur am weitesten ausgedehnten Position des Fraktionssammlers …

Representative Results

Das Perfusionssystem mit mehreren Mediumquellen aus Abschnitt 5 des Protokolls wurde verwendet, um die Expressionsdynamik eines Reportergens zu messen, das durch den Kernfaktor kappa-light-chain-enhancer von aktivierten B-Zellen (NF-κB) Transkriptionsfaktor in menschlichen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293) als Reaktion auf einen 1,5 h Puls des Tumornekrosefaktors alpha (TNF-α) angetrieben wird. HEK293-Zellen wurden stabil unter Verwendung von lentiviralen Vektoren mit einem Genkonstrukt transduziert, das Gaussia lu…

Discussion

Diese Arbeit beschreibt den Aufbau und Betrieb eines Perfusionszellkultursystems mit mehreren Medienquellen, demonstriert mit einem spezifischen Beispiel, in dem die Dynamik der NF-κB-gesteuerten Genexpression als Reaktion auf einen transienten Puls von TNF-α gemessen wurde. Die RTDs der Komponenten des Perfusionssystems wurden gemessen und modelliert, und die Signalfaltung wurde verwendet, um sowohl die Exposition der Zellen gegenüber dem TNF-α-Puls als auch die TNF-α-Verteilung in den gesammelten Abwassermediumfra…

Materials

18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning	VWR	89091-010	Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells	Millipore Sigma	CLS3548	Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	Fisher Scientific	720081	Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End	Fisher Scientific	14-961-26	Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	2707410	300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	21600010	Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.