Denne artikkelen presenterer en metode for å konstruere og drive et billig, flerkanals perfusjonscellekultursystem for å måle dynamikken i sekresjon og absorpsjonshastigheter av løsemidler i cellulære prosesser. Systemet kan også utsette celler for dynamiske stimulusprofiler.
Visse celle- og vevsfunksjoner opererer innenfor den dynamiske tidsskalaen minutter til timer som er dårlig løst av konvensjonelle kultursystemer. Dette arbeidet har utviklet et billig perfusjonsbioreaktorsystem som gjør at kulturmediet kontinuerlig kan perfunderes i en cellekulturmodul og fraksjoneres i en nedstrømsmodul for å måle dynamikk på denne skalaen. Systemet er konstruert nesten utelukkende av kommersielt tilgjengelige deler og kan parallelliseres for å utføre uavhengige eksperimenter i konvensjonelle flerbrønnscellekulturplater samtidig. Denne videoartikkelen viser hvordan du monterer baseoppsettet, som bare krever en enkelt flerkanals sprøytepumpe og en modifisert fraksjonssamler for å perfusere opptil seks kulturer parallelt. Nyttige varianter på den modulære designen presenteres også som muliggjør kontrollert stimuleringsdynamikk, for eksempel løsemiddelpulser eller farmakokinetisk-lignende profiler. Det er viktig at når løsemiddelsignaler beveger seg gjennom systemet, blir de forvrengt på grunn av løsemiddelspredning. Videre beskrives en metode for å måle oppholdstidsfordelingene (RTD) av komponentene i perfusjonsoppsettet med en tracer ved bruk av MATLAB. RTD-er er nyttige for å beregne hvordan løsemiddelsignaler forvrenges av strømmen i flerromssystemet. Dette systemet er svært robust og reproduserbart, slik at grunnleggende forskere enkelt kan ta det i bruk uten behov for spesialiserte fabrikasjonsanlegg.
Mange viktige biologiske prosesser forekommer i celle- og vevskulturer på tidsskalaen fra minutter til timer 1,2,3. Mens noen av disse fenomenene kan observeres og registreres på en automatisert måte ved hjelp av time-lapse mikroskopi4, bioluminescens1 eller andre metoder, utføres eksperimenter som involverer innsamling av kultur supernatantprøver for kjemisk analyse ofte manuelt i statiske cellekulturer. Manuell prøvetaking begrenser muligheten for visse studier på grunn av ulempen med hyppige eller ettertidsprøver. Ytterligere mangler ved statiske kulturmetoder inkluderer eksperimenter som involverer kontrollerte, forbigående eksponeringer for kjemiske stimuli. I statiske kulturer må stimuli legges til og fjernes manuelt, og stimulusprofiler er begrenset til trinnendringer over tid, mens mediumendringer også legger til og fjerner andre mediumkomponenter, noe som kan påvirke celler på en ukontrollert måte5. Fluidiske systemer kan overvinne disse utfordringene, men eksisterende enheter utgjør andre utfordringer. Mikrofluidiske enheter kommer med de uoverkommelige kostnadene ved spesialutstyr og opplæring for å produsere og bruke, krever mikroanalytiske metoder for å behandle prøver, og celler er vanskelige å gjenopprette fra enhetene etter perfusjon6. Få makrofluidiske systemer er opprettet for de typer eksperimenter som er beskrevet her 7,8,9,10, og de er bygget av flere tilpassede deler laget internt og krever flere pumper eller fraksjonssamlere. Videre er forfatterne ikke klar over noen kommersielt tilgjengelige makrofluidiske perfusjonscellekultursystemer annet enn omrørte tankbioreaktorer for suspensjonskultur, som er nyttige for bioproduksjon, men er ikke designet for modellering og studier av fysiologi.
Forfatterne rapporterte tidligere om utformingen av et billig perfusjonsbioreaktorsystem som består nesten utelukkende av kommersielt tilgjengelige deler11. Basisversjonen av systemet gjør det mulig å oppbevare flere kulturer i en brønnplate i en CO2-inkubator og kontinuerlig perfunderes med medium fra en sprøytepumpe, mens avløpsvannmediumstrømmene fra kulturene automatisk fraksjoneres i prøver over tid ved hjelp av en fraksjonssamler med en tilpasset modifikasjon. Dermed muliggjør dette systemet automatisert prøvetaking av kulturmedium supernatant og kontinuerlig løsemiddelinngang til kulturene over tid. Systemet er makrofluidisk og modulært og kan enkelt endres for å møte behovene til nye eksperimentdesign.
Det overordnede målet med metoden som presenteres her er å konstruere, karakterisere og bruke et perfusjonscellekultursystem som muliggjør eksperimenter der sekresjonen eller absorpsjonshastighetene til stoffer av celler over tid måles, og / eller celler blir utsatt for presise, forbigående løsemiddelsignaler. Denne videoartikkelen forklarer hvordan du monterer baseoppsettet, som er i stand til å perfusere opptil seks cellekulturer samtidig ved hjelp av en enkelt sprøytepumpe og modifisert fraksjonssamler. To nyttige varianter på basesystemet som benytter seg av ekstra pumper og deler for å muliggjøre eksperimenter som utsetter celler for forbigående løsemiddelkonsentrasjonssignaler, inkludert korte pulser og farmakokinetisk-lignende profiler12, presenteres også, vist i figur 1.
Figur 1: Tre variasjoner på perfusjonssystemdesignet. (Øverst) Det grunnleggende perfusjonssystemet. (Midten) Perfusjonssystemet med stoppekran for flere middels kilder. (Nederst) Perfusjonssystemet med en omrørt tank for å etterligne et godt blandet distribusjonsvolum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
På grunn av spredning og diffusjon i strømmen blir løsemiddelsignalene forvrengt eller “smurt” når de beveger seg gjennom strømningssystemet. Denne forvrengningen kan kvantifiseres ved bruk av oppholdstidsfordelinger (RTD)13. Denne artikkelen forklarer hvordan du utfører sporingseksperimenter på komponenter i perfusjonssystemet (figur 2), og gir MATLAB-skript for å generere RTD-er fra målte data. En detaljert forklaring på denne analysen finnes i forfatternes forrige artikkel11. Ytterligere MATLAB-skript tilpasser passende funksjoner til RTD-ene og trekker ut fysiske parametere, og utfører signalkonvolusjon ved hjelp av RTD-er for å forutsi hvordan løsemiddelsignalinngang fra brukeren vil forplante og forvrenge gjennom perfusjonssystemet14.
Figur 2: Fordeling av oppholdstid. RTD-ene til strømningssystemkomponenter, for eksempel denne lengden på slangen, måles ved å legge inn en puls av tracer til systemet og måle hvordan den “smører” når den går ut i de innsamlede fraksjonene. Dette tallet er modifisert fra Erickson et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Dette arbeidet beskriver samlingen og driften av et perfusjonscellekultursystem med flere mediumkilder demonstrert med et spesifikt eksempel der dynamikken til NF-κB-drevet genuttrykk som respons på en forbigående puls av TNF-α ble målt. RTD-ene til perfusjonssystemkomponentene ble målt og modellert, og signalkonvolusjon ble brukt til å forutsi både cellens eksponering for TNF-α puls og TNF-α fordeling i de oppsamlede avløpsvannmediumfraksjonene. Cellene ble utsatt for puls og fraksjoner ble samlet i 40 timer,…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble utført med støtte under Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 og T32 GM008339 fra National Institutes of Health.
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |