Cerebrale organoider giver hidtil usete muligheder for at studere organudvikling og human sygdomspatologi. Selvom der er opnået stor succes med cerebrale organoidkultursystemer, er der stadig operationelle vanskeligheder med at anvende denne teknologi. Den nuværende protokol beskriver en cerebral organoid procedure, der letter medium forandring og organoid overførsel.
På nuværende tidspunkt er cerebral organoidkulturteknologi stadig kompliceret at betjene og vanskelig at anvende i stor skala. Det er nødvendigt at finde en enkel og praktisk løsning. Derfor foreslås en mere gennemførlig cerebral organoidprotokol i denne undersøgelse. For at løse de uundgåelige ulemper ved medium ændring og organoidoverførsel i den tidlige fase optimerer den nuværende forskning driftsteknologien ved at anvende ingeniørprincippet. En blød lyslampe blev vedtaget til sideværts at belyse embryoidlegemet (EB) prøver, så EB’erne kunne ses med det blotte øje gennem den forbedrede diffuse refleksionseffekt. Ved hjælp af princippet om sekundær strømning genereret ved rotation samles organoiderne mod midten af brønden, hvilket letter driften af medium ændring eller organoidoverførsel. Sammenlignet med den dispergerede celle sætter den embryoide krop sig hurtigere i pipetten. Ved hjælp af dette fænomen kan de fleste af de frie celler og døde cellefragmenter fjernes effektivt på en enkel måde, hvilket forhindrer EB’er i at pådrage sig skader fra centrifugering. Denne undersøgelse letter driften af cerebral organoidkultur og hjælper med at fremme anvendelsen af hjerneorganoider.
Sammenlignet med todimensionale (2D) kultursystemer har tredimensionelle (3D) kultursystemer flere fordele, herunder ægte replikation og effektiv reproduktion af komplekse strukturer af visse organer1. Derfor er cerebrale organoider en af de vigtige hjælpemetoder til forskningsområderne for menneskelig hjerneudvikling og sygdom2, lægemiddelscreening og celleterapi.
Dyrkning af cerebrale organoider ved den roterende suspensionsmetode er befordrende for deres udvikling og modning3. Selvom cerebrale organoidkultursystemer har opnået stor succes, står de stadig over for kritiske udfordringer, der begrænser deres anvendelse. For eksempel involverer manuel dyrkning komplicerede manipulationstrin og introducerer hindringer for at opnå store applikationer. Derudover er der på hvert udviklingsstadium i kulturen af cerebrale organoider behov for ændringer i forskellige medier og cytokiner4. I det tidlige stadium har organoiderne eller EB’erne imidlertid små størrelser (ca. 200 μm til 300 μm) og er næsten visuelt utilgængelige uden passende apparater. Uundgåeligt skylles en vis mængde dyrebare organoidprøver væk, når mediet ændres. Mange teknikker er blevet udforsket for at overvinde dette i andre former for organoidkulturer, og nogle eksempler inkluderer nedsænkning af hele organoidchips i et kulturmedium i 3 dage uden intervention5; tilsætning af et friskt medium gennem dækslippen, efter at det gamle medium er absorberet ved hjælp af absorberende papir5; eller anvendelse af komplekse mikrofluidiske rørledninger til væskeudveksling 6,7,8. En anden hindring, der opstår i den tidlige fase af organoiddyrkning, er vanskeligheden ved at opnå direkte observationer med det blotte øje, hvilket kan forårsage dårlige operationer, der fører til organoidskade og tab under organoidoverførselstrinnene. Derfor er det nødvendigt at etablere en mere gennemførlig protokol, der letter medium forandring og organoidoverførsel for at generere organoider.
En tilsvarende optimeret drift baseret på tekniske principper foreslås for at overvinde disse problemer, hvilket betydeligt og bekvemt letter mange organoidprocedurer. I naturen, når solen skinner ind i et hus gennem et vindueshul, kan det blotte øje se støvet danse i lysstrålen. På grund af den diffuse refleksion af sollys på støv brydes noget lys ind i øjeæblet for at producere et visuelt billede. Inspireret af princippet om dette fænomen 9,10 lavede denne undersøgelse en blød lyslampe og oplyste EB’erne sideværts. Det blev konstateret, at EB’er kunne være visuelt klare uden at påvirke visningsomfanget. En sekundær strømning, der peger mod midten, genereres i væsken ved at dreje kulturpladen på grund af hvirvelstrømme11. Oprindeligt spredte EB’er akkumuleres i midten af pladen. Baseret på dette og det fænomen, at organoidernes sedimentationshastighed er hurtigere end cellernes, foreslås en nem driftsmetode til mediumændring og organoidoverførsel uden centrifugering. Organoiderne i kulturmediet kan effektivt adskilles fra frie celler og døde cellefragmenter gennem denne overførselsoperation.
Her foreslås en protokol, der er let at betjene, for at generere cerebrale organoider fra humane pluripotente stamceller. Driftsteknologien blev optimeret ved at anvende ingeniørprincippet, hvilket gjorde operationer i 3D-kultur så enkle og gennemførlige som dem i 2D-kultur. Den forbedrede væskeudvekslingsmetode og organoidoverførselsoperation er også nyttige til andre typer organoidkultur og design af automatiske kulturmaskiner.
Cerebrale organoider åbner nye veje til medicinsk forskning. Mange nyttige anvendelser af denne teknologi er kun begyndt at blive udforsket28. Denne forskning viste, at transkriptomsekventeringsresultaterne af genetisk syge cerebrale organoider og normale cerebrale organoider kan afspejle forskellene mellem sygdom og sundhed. For eksempel er RNA-seq-dataanalyseresultaterne (figur 3B) i overensstemmelse med mange rapporterede undersøgelser af SCA3-sygdomme 29,30,31,3…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2020A0505100062), Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) og Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-projektet (til Bangzhu Chen).
0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
Weblink | |||
Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |