הקלה על תרבית אורגנואידית מוחית באמצעות תאורת אור רך לרוחב
Summary
אורגנואידים מוחיים מספקים הזדמנויות חסרות תקדים לחקר התפתחות איברים ופתולוגיה של מחלות אנושיות. למרות שהצלחה רבה הושגה עם מערכות תרבית אורגנואידיות מוחיות, עדיין ישנם קשיים תפעוליים ביישום טכנולוגיה זו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אורגנואידי מוחי המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים.
Abstract
נכון לעכשיו, טכנולוגיית תרבית אורגנואידית מוחית עדיין מסובכת לתפעול וקשה ליישום בקנה מידה גדול. יש צורך למצוא פתרון פשוט ומעשי. לכן, פרוטוקול אורגנואידים מוחי אפשרי יותר מוצע במחקר הנוכחי. כדי לפתור את אי הנוחות הבלתי נמנעת בשינוי בינוני והעברה אורגנואידית בשלב מוקדם, המחקר הנוכחי מייעל את טכנולוגיית הפעולה על ידי יישום העיקרון ההנדסי. מנורת אור רכה אומצה כדי להאיר לרוחב את דגימות הגוף העוברי (EB), מה שמאפשר לראות את ה-EBs בעין בלתי דרך אפקט ההשתקפות המפוזרת המשופרת. באמצעות העיקרון של זרימה משנית שנוצרת על ידי סיבוב, האורגנואידים מתאספים לכיוון מרכז הבאר, מה שמקל על פעולת השינוי הבינוני או העברת האורגנואידים. בהשוואה לתא המפוזר, הגוף העוברי מתיישב מהר יותר בפיפטה. באמצעות תופעה זו, ניתן להסיר ביעילות את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים בצורה פשוטה, ולמנוע מ-EBs לגרום נזק מצנטריפוגה. מחקר זה מקל על הפעולה של תרבית אורגנואידים מוחית ומסייע לקדם את היישום של אורגנואידים במוח.
Introduction
בהשוואה למערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות), למערכות תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) יש מספר יתרונות, כולל שכפול אמיתי ושחזור יעיל של מבנים מורכבים של איברים מסוימים1. לכן, אורגנואידים מוחיים הם אחת משיטות העזר החשובות לתחומי המחקר של התפתחות המוח האנושי ומחלות2, בדיקת תרופות וטיפול בתאים.
גידול אורגנואידים מוחיים בשיטת ההשעיה המסתובבת תורם להתפתחותם ולהבשלתם3. למרות שמערכות תרביות אורגנואידיות מוחיות זכו להצלחה רבה, הן עדיין מתמודדות עם אתגרים קריטיים המגבילים את יישומן. לדוגמה, טיפוח ידני כרוך בשלבי מניפולציה מסובכים ומציג מכשולים להשגת יישומים בקנה מידה גדול. בנוסף, בכל שלב התפתחותי בתרבית האורגנואידים המוחיים, יש צורך בשינויים במדיה ובציטוקינים שונים4. עם זאת, בשלב המוקדם, האורגנואידים או ה- EBs הם בעלי גדלים זעירים (כ-200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר) והם כמעט בלתי נגישים מבחינה חזותית ללא מנגנון מתאים. באופן בלתי נמנע, כמות מסוימת של דגימות אורגנואידיות יקרות נשטפות כאשר המדיום משתנה. טכניקות רבות נחקרו כדי להתגבר על כך בסוגים אחרים של תרביות אורגנואידיות, וכמה דוגמאות כוללות טבילה של שבבי אורגנואידים שלמים במדיום תרבית למשך 3 ימים ללא התערבות5; הוספת מדיום טרי דרך הכיסוי לאחר שהמדיום הישן נספג באמצעות נייר סופג5; או החלת צינורות מיקרופלואידיים מורכבים להחלפת נוזלים 6,7,8. מכשול נוסף שנתקל בו בשלב המוקדם של גידול האורגנואידים הוא הקושי להשיג תצפיות ישירות בעין בלתי, מה שעלול לגרום לפעולות לקויות שמובילות לנזק ואובדן אורגנואידים במהלך שלבי העברת האורגנואידים. לכן, יש צורך להקים פרוטוקול ריאלי יותר המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים כדי ליצור אורגנואידים.
פעולה מותאמת המתאימה המבוססת על עקרונות הנדסיים מוצעת כדי להתגבר על בעיות אלה, אשר באופן משמעותי ונוח מקל על הליכים אורגנואידים רבים. בטבע, כאשר השמש זורחת לתוך בית דרך מרווח חלון, העין הבלתי יכולה לראות את האבק רוקד בקרן האור. בשל ההשתקפות המפוזרת של אור השמש על האבק, חלק מהאור נשבר לתוך גלגל העין כדי לייצר תמונה חזותית. בהשראת העיקרון של תופעה זו 9,10, מחקר זה יצר מנורת אור רכה והאיר את ה- EBs לרוחב. נמצא כי EBs יכולים להיות ברורים מבחינה ויזואלית מבלי להשפיע על היקף הצפייה. זרימה משנית המצביעה על המרכז נוצרת בנוזל על ידי סיבוב צלחת התרבית עקב זרמי אדי11. EBs מפוזרים במקור מצטברים במרכז הצלחת. בהתבסס על זה, ועל התופעה כי מהירות השקיעה של אורגנואידים היא מהירה יותר מזו של תאים, מוצעת שיטת פעולה קלה של שינוי בינוני והעברה אורגנואידית ללא צנטריפוגה. האורגנואידים במדיום התרבית יכולים להיות מופרדים ביעילות מתאים חופשיים ושברי תאים מתים באמצעות פעולת העברה זו.
כאן, פרוטוקול קל לתפעול מוצע כדי ליצור אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. טכנולוגיית הפעולה עברה אופטימיזציה על ידי יישום העיקרון ההנדסי, מה שהופך את הפעולות בתרבות התלת-ממדית לפשוטות וישימות כמו אלה שבתרבות הדו-ממדית. שיטת החלפת הנוזלים המשופרת ופעולת העברת האורגנואידים מועילות גם לסוגים אחרים של תרבית אורגנואידים ולתכנון של מכונות תרבית אוטומטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אורגנואידים מוחיים פותחים אפיקים חדשים למחקר רפואי. יישומים שימושיים רבים של טכנולוגיה זו מתחילים להיחקר רק28. מחקר זה מצא כי תוצאות ריצוף השעתוק של אורגנואידים מוחיים חולים גנטית ואורגנואידים מוחיים רגילים יכולות לשקף את ההבדלים בין מחלה לבריאות. לדוגמה, תוצאות ניתוח הנתונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מענק מס ‘ 2020A0505100062), פרויקט נושאי מפתח למדע וטכנולוגיה של העיר גואנגג’ואו (מענק מס ‘201904020025), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘31872800, 32070582, 82101937), ופרויקט מענק המחקר הפוסט-דוקטורט של העיר גואנגג’ואו (לבנגז’ו צ’ן).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
