横方向ソフトライト照明 による 大脳オルガノイド培養の促進
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases,The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences,Wuyi University
Summary
脳オルガノイドは、臓器の発達とヒトの疾患病理を研究するための前例のない機会を提供します。脳オルガノイド培養系では大きな成功を収めていますが、この技術を適用するには運用上の困難が依然としてあります。本プロトコールは、培地交換およびオルガノイド移動を容易にする大脳オルガノイド手順を記述する。
Abstract
現在、大脳オルガノイド培養技術は依然として操作が複雑であり、大規模に適用することは困難である。シンプルで実用的な解決策を見つける必要があります。したがって、より実現可能な脳オルガノイドプロトコルが本研究において提案されている。培地交換やオルガノイド移動における避けられない不便さを早期に解決するため、現在の研究では工学原理を応用して運用技術を最適化しています。軟質ライトランプを採用して胚様体(EB)サンプルを横方向に照らし、拡散反射効果を高めてEBを肉眼で見ることができました。回転によって生成される二次流れの原理を使用して、オルガノイドは井戸の中心に向かって集まり、培地交換またはオルガノイド移動の動作を容易にする。分散した細胞と比較して、胚様体はピペット内でより速く沈降する。この現象を使用すると、ほとんどの遊離細胞および死細胞断片を簡単な方法で効果的に除去することができ、EBが遠心分離による損傷を被るのを防ぐことができる。この研究は、脳オルガノイド培養の操作を容易にし、脳オルガノイドの適用を促進するのに役立つ。
Introduction
2次元(2D)培養系と比較して、3次元(3D)培養系は、特定の器官の真の複製および複雑な構造の効率的な再生を含むいくつかの利点を有する1。したがって、脳オルガノイドは、ヒトの脳の発達や疾患2、薬物スクリーニング、細胞治療などの研究分野にとって重要な補助方法の一つである。
回転懸濁法によって大脳オルガノイドを培養することは、それらの発達および成熟に資する3.脳オルガノイド培養系は大きな成功を収めていますが、依然としてその適用を制限する重大な課題に直面しています。例えば、手作業による栽培は複雑な操作工程を伴い、大規模な施用を実現する上での障害となります。さらに、脳オルガノイドの培養における各発達段階では、異なる培地およびサイトカインの変化が必要である4。しかし、初期段階では、オルガノイドまたはEBは小さなサイズ(約200μm〜300μm)を有し、適切な装置なしではほとんど視覚的にアクセスできない。必然的に、培地を交換すると、一定量の貴重なオルガノイドサンプルが洗い流されます。他の種類のオルガノイド培養においてこれを克服するために多くの技術が探求されており、いくつかの例には、オルガノイドチップ全体を介入なしに3日間培養培地に浸漬することが含まれる5;古い媒体が吸収紙5を用いて吸収された後、カバースリップを通して新鮮な媒体を添加するステップと、または流体交換のために複雑なマイクロ流体パイプラインを適用する6,7,8。オルガノイド培養の初期段階で遭遇するもう一つの障害は、肉眼で直接観察を達成することの難しさであり、オルガノイド移送ステップ中にオルガノイドの損傷および損失につながる貧弱な操作を引き起こす可能性がある。したがって、オルガノイドを生成するための培地交換およびオルガノイド移動を容易にする、より実現可能なプロトコルを確立する必要がある。
これらの問題を克服するために、工学原理に基づく対応する最適化された操作が提案され、これは多くのオルガノイド手順を有意かつ便利に容易にする。自然界では、太陽が窓の隙間から家に照らされると、肉眼では光線の中で踊るほこりを見ることができます。ほこりに太陽光が拡散反射するため、一部の光が眼球に屈折して視覚的な画像が生成されます。この現象9,10の原理に触発されて、この研究は柔らかいライトランプを作り、EBを横方向に照らしました。EB は、表示範囲に影響を与えずに視覚的に明瞭であることがわかりました。渦電流11により培養プレートを回転させることにより、中心を指す二次流れが液体中に発生する。もともと分散したEBはプレートの中央に蓄積します。これに基づき、オルガノイドの沈降速度が細胞の沈降速度よりも速いという現象や、遠心分離を行わずに培地交換やオルガノイド移送の容易な操作方法が提案されている。培養液中のオルガノイドは、この移入操作によって遊離細胞および死細胞断片から効果的に分離することができる。
ここでは、ヒト多能性幹細胞から脳オルガノイドを生成するために、操作が容易なプロトコルが提案されている。操作技術は、エンジニアリング原理を適用することで最適化され、3D文化での操作を2D文化の操作と同じくらいシンプルで実現可能にしました。改善された液体交換法およびオルガノイド移送操作は、他のタイプのオルガノイド培養および自動培養機の設計にも有用である。
Protocol
議定書はヘルシンキ宣言に従って実施された。広州医科大学第三附属病院の倫理委員会より承認を得ました(医学倫理審査[2021]第022号)。実験の前に、各培地をユルゲン・A・ノブリッヒの式12 (補足表1〜4)に従って調製し、または市販の脳オルガノイドキットを使用した( 材料表参照)。本研究で用いたiPS細胞は、当研究室が事前に確立したものであり?…
Representative Results
本研究は、iPS細胞(図2B)を脳オルガノイド(図2C)に誘導した。初期段階で栽培されたEBsはOCT4マーカー(図2A)を発現し、良好な多能性を示した。後の段階では、EBは成熟した脳オルガノイドに発達した(図2D)。この研究では、正常な健常者およびSCA3患者からiPS細胞を脳オルガノイドに培養した(?…
Discussion
脳オルガノイドは、医学研究のための新しい道を開きます。この技術の多くの有用な応用は、まだ探求され始めたばかりである28。この研究は、遺伝的に罹患した大脳オルガノイドと正常な脳オルガノイドのトランスクリプトームシーケンシング結果が、疾患と健康の違いを反映し得ることを見出した。例えば、RNA-seqデータ解析結果(図3B)は、SCA3疾患?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、広東省自然科学財団(助成番号2020A0505100062)、広州市科学技術重点プロジェクト(助成第201904020025号)、中国国家自然科学財団(助成第31872800号、32070582、82101937)、広州市ポスドク研究助成事業(陳邦珠市宛)の支援を受けた。
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
Cite This Article
Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen, D., Zhang, Y., Sun, X. Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination. J. Vis. Exp. (184), e63989, doi:10.3791/63989 (2022).