Facilitare la coltura di organoidi cerebrali tramite illuminazione laterale a luce soffusa
Summary
Gli organoidi cerebrali offrono opportunità senza precedenti per lo studio dello sviluppo degli organi e della patologia delle malattie umane. Sebbene sia stato ottenuto un grande successo con i sistemi di coltura di organoidi cerebrali, ci sono ancora difficoltà operative nell’applicazione di questa tecnologia. Il presente protocollo descrive una procedura organoide cerebrale che facilita il cambiamento del mezzo e il trasferimento degli organoidi.
Abstract
Allo stato attuale, la tecnologia di coltura degli organoidi cerebrali è ancora complicata da utilizzare e difficile da applicare su larga scala. È necessario trovare una soluzione semplice e pratica. Pertanto, nel presente studio viene proposto un protocollo organoide cerebrale più fattibile. Per risolvere l’inevitabile inconveniente nel cambio del mezzo e nel trasferimento degli organoidi nella fase iniziale, la ricerca attuale ottimizza la tecnologia operativa applicando il principio ingegneristico. Una lampada a luce morbida è stata adottata per illuminare lateralmente i campioni del corpo embrionale (EB), consentendo agli EB di essere visti ad occhio nudo attraverso l’effetto di riflessione diffusa potenziato. Utilizzando il principio del flusso secondario generato dalla rotazione, gli organoidi si raccolgono verso il centro del pozzo, il che facilita l’operazione di cambio medio o trasferimento organoide. Rispetto alla cellula dispersa, il corpo embrioide si deposita più velocemente nella pipetta. Utilizzando questo fenomeno, la maggior parte delle cellule libere e dei frammenti di cellule morte possono essere efficacemente rimossi in modo semplice, impedendo agli EB di incorrere in danni da centrifugazione. Questo studio facilita il funzionamento della coltura di organoidi cerebrali e aiuta a promuovere l’applicazione di organoidi cerebrali.
Introduction
Rispetto ai sistemi di coltura bidimensionali (2D), i sistemi di coltura tridimensionali (3D) presentano diversi vantaggi, tra cui la replica autentica e la riproduzione efficiente di strutture complesse di alcuni organi1. Pertanto, gli organoidi cerebrali sono uno degli importanti metodi ausiliari per i campi di ricerca dello sviluppo del cervello umano e della malattia2, dello screening farmacologico e della terapia cellulare.
La coltura di organoidi cerebrali con il metodo della sospensione rotante favorisce il loro sviluppo e la loro maturazione3. Sebbene i sistemi di coltura di organoidi cerebrali abbiano ottenuto un grande successo, devono ancora affrontare sfide critiche che ne limitano l’applicazione. Ad esempio, la coltivazione manuale comporta complicate fasi di manipolazione e introduce ostacoli al raggiungimento di applicazioni su larga scala. Inoltre, in ogni fase dello sviluppo nella coltura di organoidi cerebrali, sono necessari cambiamenti in diversi mezzi e citochine4. Tuttavia, nella fase iniziale, gli organoidi o EB hanno dimensioni minuscole (circa 200 μm a 300 μm) e sono quasi visivamente inaccessibili senza un apparato appropriato. Inevitabilmente, una certa quantità di preziosi campioni di organoidi viene lavata via quando il mezzo viene cambiato. Molte tecniche sono state esplorate per superare questo in altri tipi di colture organoidiche, e alcuni esempi includono l’immersione di interi chip organoidi in un terreno di coltura per 3 giorni senza intervento5; aggiungere un mezzo fresco attraverso il coperchio dopo che il vecchio mezzo è stato assorbito con carta assorbente5; o applicando tubazioni microfluidiche complesse per lo scambio di fluidi 6,7,8. Un altro ostacolo incontrato nella fase iniziale della coltivazione degli organoidi è la difficoltà di ottenere osservazioni dirette ad occhio nudo, che possono causare operazioni scadenti che portano a danni organoidi e perdite durante le fasi di trasferimento degli organoidi. Pertanto, è necessario stabilire un protocollo più fattibile che faciliti il cambiamento del mezzo e il trasferimento degli organoidi per generare organoidi.
Per superare questi problemi viene proposta una corrispondente operazione ottimizzata basata su principi ingegneristici, che facilita in modo significativo e conveniente molte procedure organoidiche. In natura, quando il sole splende in una casa attraverso una finestra, l’occhio nudo può vedere la polvere danzare nel fascio di luce. A causa del riflesso diffuso della luce solare sulla polvere, una parte della luce viene rifratta nel bulbo oculare per produrre un’immagine visiva. Ispirato al principio di questo fenomeno 9,10, questo studio ha realizzato una lampada a luce morbida e illuminato gli EB lateralmente. Si è scoperto che gli EB potevano essere visivamente chiari senza influire sull’ambito di visualizzazione. Un flusso secondario che punta al centro viene generato nel liquido ruotando la piastra di coltura a causa delle correnti parassite11. Gli EB originariamente dispersi si accumulano al centro della piastra. Sulla base di questo, e del fenomeno che la velocità di sedimentazione degli organoidi è più veloce di quella delle cellule, viene proposto un metodo di facile funzionamento del cambio del mezzo e del trasferimento organoide senza centrifugazione. Gli organoidi nel terreno di coltura possono essere efficacemente separati dalle cellule libere e dai frammenti di cellule morte attraverso questa operazione di trasferimento.
Qui, viene proposto un protocollo facile da usare per generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti umane. La tecnologia operativa è stata ottimizzata applicando il principio di ingegneria, rendendo le operazioni nella cultura 3D semplici e fattibili come quelle nella cultura 2D. Il metodo di scambio liquido migliorato e l’operazione di trasferimento degli organoidi sono utili anche per altri tipi di coltura organoide e per la progettazione di macchine automatiche per la coltura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli organoidi cerebrali aprono nuove strade per la ricerca medica. Molte applicazioni utili di questa tecnologia stanno solo iniziando ad essere esplorate28. Questa ricerca ha scoperto che i risultati del sequenziamento del trascrittoma di organoidi cerebrali geneticamente malati e normali organoidi cerebrali possono riflettere le differenze tra malattia e salute. Ad esempio, i risultati dell’analisi dei dati RNA-seq (Figura 3B) sono coerenti con molti studi riportati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (grant n. 2020A0505100062), dal Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) e dal guangzhou City Postdoctoral Research Grant project (a Bangzhu Chen).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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