Underlätta cerebral organoidkultur via lateral mjuk ljusbelysning
Summary
Cerebrala organoider ger oöverträffade möjligheter att studera organutveckling och mänsklig sjukdomspatologi. Även om stor framgång har uppnåtts med cerebrala organoidkultursystem, finns det fortfarande operativa svårigheter att tillämpa denna teknik. Detta protokoll beskriver ett cerebralt organoidförfarande som underlättar mediumförändring och organoidöverföring.
Abstract
För närvarande är cerebral organoidodlingsteknik fortfarande komplicerad att använda och svår att tillämpa i stor skala. Det är nödvändigt att hitta en enkel och praktisk lösning. Därför föreslås ett mer genomförbart cerebralt organoidprotokoll i den aktuella studien. För att lösa det oundvikliga besväret vid mediumförändring och organoidöverföring i ett tidigt skede optimerar den nuvarande forskningen driftstekniken genom att tillämpa ingenjörsprincipen. En mjuk ljuslampa antogs för att i sidled belysa embryoidkroppsproverna (EB), vilket gör att DE EBs kan ses med blotta ögat genom den förbättrade diffusa reflektionseffekten. Med hjälp av principen om sekundärt flöde som genereras genom rotation samlas organoiderna mot mitten av brunnen, vilket underlättar driften av mediumförändring eller organoidöverföring. Jämfört med den dispergerade cellen sätter sig embryoidkroppen snabbare i pipetten. Med hjälp av detta fenomen kan de flesta fria celler och döda cellfragment effektivt avlägsnas på ett enkelt sätt, vilket förhindrar att EBs ådrar sig skador från centrifugering. Denna studie underlättar driften av cerebral organoidkultur och hjälper till att främja tillämpningen av hjärnorganoider.
Introduction
Jämfört med tvådimensionella (2D) odlingssystem har tredimensionella (3D) odlingssystem flera fördelar, inklusive äkta replikering och effektiv reproduktion av komplexa strukturer av vissa organ1. Därför är cerebrala organoider en av de viktiga hjälpmetoderna för forskningsområdena mänsklig hjärnutveckling och sjukdom2, läkemedelsscreening och cellterapi.
Odling av cerebrala organoider med den roterande suspensionsmetoden bidrar till deras utveckling och mognad3. Även om cerebrala organoidkultursystem har uppnått stor framgång, står de fortfarande inför kritiska utmaningar som begränsar deras tillämpning. Till exempel innebär manuell odling komplicerade manipulationssteg och introducerar hinder för att uppnå storskaliga applikationer. Dessutom behövs vid varje utvecklingsstadium i kulturen av cerebrala organoider förändringar i olika medier och cytokiner4. I det tidiga skedet har emellertid organoiderna eller DE små storlekarna (cirka 200 μm till 300 μm) och är nästan visuellt otillgängliga utan lämplig apparat. Oundvikligen spolas en viss mängd värdefulla organoidprover bort när mediet byts ut. Många tekniker har utforskats för att övervinna detta i andra typer av organoidkulturer, och några exempel inkluderar nedsänkning av hela organoidchips i ett odlingsmedium i 3 dagar utan intervention5; tillsätt ett nytt medium genom täckglaset efter att det gamla mediet absorberats med absorberande papper5; eller applicera komplexa mikrofluidiska rörledningar för vätskeutbyte 6,7,8. Ett annat hinder som uppstår i det tidiga skedet av organoidodling är svårigheten att uppnå direkta observationer med blotta ögat, vilket kan orsaka dåliga operationer som leder till organoidskador och förlust under organoidöverföringsstegen. Därför är det nödvändigt att upprätta ett mer genomförbart protokoll som underlättar mediumförändring och organoidöverföring för att generera organoider.
En motsvarande optimerad operation baserad på tekniska principer föreslås för att övervinna dessa problem, vilket avsevärt och bekvämt underlättar många organoidprocedurer. I naturen, när solen skiner in i ett hus genom ett fönstergap, kan blotta ögat se dammet dansa i ljusstrålen. På grund av den diffusa reflektionen av solljus på damm bryts lite ljus in i ögongloben för att producera en visuell bild. Inspirerad av principen om detta fenomen 9,10 gjorde denna studie en mjuk ljuslampa och upplyste DE EBs i sidled. Det konstaterades att de verkställande organen kunde vara visuellt tydliga utan att det påverkade tittaromfattningen. Ett sekundärt flöde som pekar mot mitten genereras i vätskan genom att rotera odlingsplattan på grund av virvelströmmar11. Ursprungligen spridda EP ackumuleras i mitten av plattan. Baserat på detta och fenomenet att organoidernas sedimenteringshastighet är snabbare än cellernas, föreslås en enkel driftsmetod för mediumförändring och organoidöverföring utan centrifugering. Organoiderna i odlingsmediet kan effektivt separeras från fria celler och döda cellfragment genom denna överföringsoperation.
Här föreslås ett protokoll som är lätt att använda för att generera cerebrala organoider från humana pluripotenta stamceller. Driftstekniken optimerades genom att tillämpa ingenjörsprincipen, vilket gjorde operationer i 3D-kultur lika enkla och genomförbara som de i 2D-kulturen. Den förbättrade vätskeutbytesmetoden och organoidöverföringsoperationen är också till hjälp för andra typer av organoidkultur och utformningen av automatiska odlingsmaskiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebrala organoider öppnar nya vägar för medicinsk forskning. Många användbara tillämpningar av denna teknik börjar bara utforskas28. Denna forskning fann att transkriptomsekvenseringsresultaten av genetiskt sjuka cerebrala organoider och normala cerebrala organoider kan återspegla skillnaderna mellan sjukdom och hälsa. Till exempel överensstämmer resultaten av RNA-seq-dataanalysen (figur 3B) med många rapporterade studier på SCA3-sjukdomar<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (bidrag nr 2020A0505100062), Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (bidrag nr 201904020025), National Natural Science Foundation of China (Bidrag nr 31872800, 32070582, 82101937) och Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-projektet (till Bangzhu Chen).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
