Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro
Summary
Hier stellen wir ein einfaches und effektives Assay-Verfahren für Resorptionsgruben-Assays mit Calciumphosphat-beschichteten Zellkulturplatten vor.
Abstract
Reife Osteoklasten sind mehrkernige Zellen, die Knochen durch die Sekretion von Säuren und Enzymen abbauen können. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen (z.B. Osteoporose und Knochenkrebs) und sind daher wichtige Forschungsgegenstände. In vitro kann ihre Aktivität durch die Bildung von Resorptionsgruben analysiert werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Pit-Assay-Methode unter Verwendung von mit Calciumphosphat (CaP) beschichteten Zellkulturplatten, die leicht visualisiert und quantifiziert werden können. Osteoklastenvorläufer, die aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) gewonnen wurden, wurden auf den beschichteten Platten in Gegenwart von osteoklastogenen Reizen kultiviert. Nach 9 Tagen Inkubation wurden Osteoklasten fixiert und für die Fluoreszenzbildgebung gefärbt, während die CaP-Beschichtung durch Calcein gefärbt wurde. Um die resorbierte Fläche zu quantifizieren, wurde die CaP-Beschichtung auf Platten mit 5% AgNO3 gefärbt und durch Hellfeldbildgebung visualisiert. Die Resorptionsgrubenfläche wurde mit ImageJ quantifiziert.
Introduction
Osteoklasten (OCs) sind gewebespezifische Makrophagen, die aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) gewonnen werden und zusammen mit Osteoblasten 1 eine zentrale Rolle beim Knochenumbauspielen. Sexualhormon-induzierte, immunologische und maligne Knochenerkrankungen, die Knochen systemisch oder lokal zerstören, sind auf übermäßige osteoklastische Aktivität zurückzuführen, einschließlich Menopause-bedingte Osteoporose2, rheumatoide Arthritis3, Parodontitis4, Myelom-Knochen-Krankheit5 und osteolytische Knochenmetastasen6. Im Gegensatz dazu können Defekte in der OC-Bildung und -Funktion auch Osteopetrose7 verursachen. HSCs werden unter Stimulation des Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF, Gensymbol ACP5) in OC-Vorläufer differenziert. In Gegenwart von M-CSF und Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden (RANKL, Gensymbol TNFSF11) differenzieren OC-Vorläufer weiter in mononukleäre OCs und fusionieren anschließend zu mehrkernigen OCs 8,9,10. Beide Zytokine M-CSF und RANKL sind unverzichtbar und ausreichend für die Induktion osteoklastischer Marker wie Calcitonin-Rezeptor (CT), Rezeptoraktivator des Kernfaktors κ B (RANK), Protonenpumpe V-ATPase, Chloridkanal 7 alpha-Untereinheit (CIC-7), Integrin β3, tartratresistente Säurephosphatase (TRAP, Gensymbol ACP5), lysosomale Cysteinprotease-Cathepsin K (CTSK) und Matrix-Metallopeptidase 9 (MMP9). Aktivierte OCs bilden eine Dichtungszone auf der Knochenoberfläche durch die Bildung eines Aktinrings mit einem gerüschten Rand11,12. Innerhalb der Dichtungszone vermitteln OCs die Resorption durch Sekretion von Protonen über die Protonenpumpe V-ATPase 12,13, MMP914 und CTSK 15, was zur Bildung von Lücken führt.
Für In-vitro-Experimente können OC-Vorläufer durch Expansion von Knochenmarkmakrophagen aus Femur und Tibia 16,17 von Mäusen sowie durch Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus Blutproben und Buffy Coats18,19,20 oder durch Differenzierung der immortalisierten murinen monozytären Zellen RAW 264.7 21,22 erhalten werden.
Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir einen osteoklastischen Resorptionsassay in CaP-beschichteten Zellkulturplatten unter Verwendung von OCs, die von primären PBMCs abgeleitet sind. Die hier verwendete CaP-beschichtete Zellkulturplattenmethode wurde von der zuvor von Patntirapong et al.17 und Maria et al.21 beschriebenen Methode übernommen und verfeinert. Um OC-Vorläufer zu erhalten, werden PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und wie zuvor beschriebenexpandiert 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode für einen osteoklastischen Resorptionsassay unter Verwendung von OCs, die in vitro von PBMCs abgeleitet und expandiert wurden. Die verwendeten CaP-beschichteten Zellkulturplatten können mit laborverfügbaren Materialien einfach vorbereitet und visualisiert werden. Zusätzlich zu den unsortierten PBMCs, die in diesem Protokoll übernommen wurden, wurden OCs, die aus murinen monozytären Zellen21 und Knochenmarkmakrophagenzellen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise vom China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394] finanziert. W.C. wurde von CSC finanziert.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
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