牛卵母細胞のミトコンドリアDNAを減少させるための二分法の使用
Summary
ここでは、ウシ卵母細胞におけるミトコンドリアDNAコピー数を有意に減少させるプロトコールを提示する(P < 0.0001)。この方法は、遠心分離および二分法を利用して卵母細胞ミトコンドリアを実質的に減少させ、再構成された種間体細胞核移植胚における発生の増大の機会を可能にし得る。
Abstract
種間体細胞核移植(iSCNT)は絶滅危惧種を救うために使用することができるが、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の2つの異なる集団が再構築された胚内に存在する:1つはレシピエント卵形質内および1つはドナー体細胞内である。このミトコンドリアヘテロプラスミーは、胚および胎児の発達上の問題につながる可能性がある。手作りのクローニングプロトコルには卵母細胞二切除が含まれ、mtDNAコピー数を減らし、再構築された胚におけるミトコンドリアヘテロプラズムの程度を低下させるために使用できる。脱蹄した成熟したウシ卵母細胞の遠心分離は、卵母細胞の一極に目に見えるミトコンドリア緻密画分を生じた。卵母細胞の透明帯は、プロナーゼ溶液への曝露によって除去した。可視ミトコンドリア画分を除去するためにマイクロブレードを用いて二分断を行った。qPCRを使用して、卵母細胞全体および二等分した卵子から抽出したDNAサンプル中に存在するmtDNAを定量し、二分切除前後のmtDNAコピー数を比較した。コピー数は、サイクル閾値、標準曲線の回帰直線式、およびmtDNA PCR産物およびゲノムPCR産物のそれぞれのサイズを含む比率を用いて計算した。1つのウシ卵母細胞は、137,904±94,768(n=38)の平均mtDNAコピー数(標準偏差±)を有していた。1つのミトコンドリア枯渇卵母細胞は、8,442±13,806(n = 33)の平均mtDNAコピー数を有していた。ミトコンドリアに富む卵母細胞中に存在する平均mtDNAコピーは、79,390±58,526 mtDNAコピーであった(n = 28)。これらの計算された平均の差は、遠心分離とその後の二分割が、元の卵母細胞(P<0.0001、一元配置分散分析によって決定される)と比較して、ミトコンドリア枯渇した卵細胞中に存在するmtDNAコピー数を有意に減少させることができることを示している。mtDNAの減少は、再構築された胚におけるミトコンドリアヘテロプラミーの程度を低下させ、おそらく標準的な胚および胎児の発達を促進するはずである。体細胞ドナー細胞からのミトコンドリア抽出物の補充もまた、胚発生を成功させるために不可欠であり得る。
Introduction
体細胞核移植(SCNT)は、1匹の動物からの除核卵母細胞と、同じ種の動物からの体細胞との融合を含む。ほとんどの場合、卵母細胞と体細胞は同じ種に由来し、出生率は6%1未満です。いくつかの研究は、2つの異なる種に由来する体細胞と卵母細胞の融合を含む種間SCNT(iSCNT)の使用を含む。これらの研究では、出生率はSCNTよりもさらに低く、通常は1%未満です1。しかしながら、iSCNTは、これらの動物由来の体細胞が生殖細胞1よりもアクセスしやすいため、絶滅危惧種を救出する方法として使用できる能力を有する。iSCNTで使用されるレシピエント卵母細胞は、多くの場合、ウシ、ブタ、およびマウスなどの国内または一般的な実験室種である。これまでになされたいくつかの試みは、生産された子孫がジェネリック内動物であったが(レシピエント卵母細胞種およびドナー細胞種は同じ属のメンバーであった)2、3、4。ジェネリック間モデル(異なる属の動物由来の卵母細胞および体細胞を利用する)はまだ生きた動物を産生しておらず、再構成された胚の大部分は、in vitro発生の8〜16細胞段階で停止する5、6、7、8。この胚発生停止の1つの可能な説明は、胚におけるミトコンドリアヘテロプラスミーの発生、すなわち単一の細胞における複数のミトコンドリアDNA(mtDNA)型の存在である。ヘテロプラスミーは、胚または生きた動物1における発生の非効率性または障害などの問題をもたらし得る。病因は、動物の生涯の後半にも起こり得る9。この問題はSCNTの子孫にも存在するが、iSCNT胚内の種間成分が問題を悪化させる。
胚性mtDNAが2つの異なる種に由来する場合、大多数を占めるレシピエント卵母細胞ミトコンドリアは、ドナー細胞の核1,10と効率的または効果的に機能しない。iSCNTで使用される2つの種の間の分類学的ギャップが大きいほど、この問題が激化する可能性が高い。内ジェネリック内で産生された生きた子孫(ボス・ガウルスおよびボス・インディカス子孫はボス・トーラス・卵母細胞を使用)、ならびに伝統的なSCNTを介して産生された子孫(例えばオービス・アリエス・卵母細胞を用いたオビス・アリエス子孫)はキメラであることが示された(2個体由来のmtDNAがこれらの動物に存在していた11、12、13)。しかし、彼らはジェネリック間SCNT胚よりもはるかに発展しました14,15。卵母細胞ミトコンドリアとドナー細胞の核との間の情報交換は、ジェネリック間胚よりもジェネリック内胚においてより成功する可能性がある16。
成熟ウシ卵母細胞中のmtDNAの量は、1つの体細胞12中に見出される量の約100倍である。この比率を低くすると、体細胞ミトコンドリアが再構築された胚内で増殖し、生産的なミトコンドリアのより大きな集団が存在することを可能にする可能性がある16。これは、順番に、発達胚15の要件を満たすためにより多くのエネルギーを提供することができる。卵母細胞または胚のmtDNAコピー数を減少させるためになされた以前の試みには、化学的適用、微小操作、およびドナー細胞種からの追加のミトコンドリアで卵母細胞または胚を補うことが含まれる16、17、18、19、20。しかし、化学的適用(2′,3′-ジデオキシシチジンなど)は胚発生には理想的ではなく、卵母細胞mtDNAコピー数を約半分に18個減少させている。マイクロマニピュレーションによる以前の卵母細胞mtDNA減少は、卵母細胞のmtDNAの平均64%しか除去していない17。ドナー細胞ミトコンドリアの補充は実行可能な選択肢であるかもしれないが、その使用はまだiSCNT研究21内で生きたジェネリック間動物を産生していない。
卵母細胞mtDNAコピー数を減らすための二分法の使用は、公表された研究においてまだ使用されていない。卵子細胞と体細胞を融合させる目的で卵母細胞を二等分することは、手作りクローニング(HMC)の前提であり、これは典型的には、中相II(MII)卵母細胞から極性体および中期プレートを除去する方法として二分割を利用する。HMCは、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ22、23、24、25、26を含むいくつかの種で子孫を首尾よく産出してきたが、典型的には二分分離前の遠心分離工程を含まない。卵母細胞の高速遠心分離を統合することで、卵母細胞の1極でミトコンドリア(したがってmtDNA)を単離することができ、マイクロブレードを使用して二等分してミトコンドリア密度の高い画分を除去することができます。その後、2つのミトコンドリア枯渇した卵胞体を、HMCの場合のように体細胞と融合させて、卵母細胞種からのmtDNAをかなり少なく含む再構成胚を形成することができる。
このプロトコルで答えようとする質問は、ヘテロプラズムmtDNAの含有量が少ない生存可能な再構築胚を生成するために、ウシ卵母細胞中のmtDNAをどのように低減するかということです。このプロトコールでは、卵母細胞を遠心分離し、二等分した。ウープラストおよびインタクトな卵母細胞のmtDNAコピー数を計算し、ウシ卵母細胞のmtDNAコピー数を減少させる上でのこの技術の有効性を決定した。
Protocol
Representative Results
Discussion
卵母細胞におけるmtDNAコピー数を減少させるために以前に用いられた方法は、それぞれの欠点を有する。卵母細胞からのミトコンドリアのマイクロマニピュレーションベースの除去は、mtDNAコピー数を平均64%減少させる27。以前は除核に使用されていたユニークな方法は、小径パスツールピペットの使用と、媒体のマイクロドロップと周囲の鉱物油との境界で透明帯を含まな?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ユタ州立大学の同僚、サンディエゴ動物園の生殖科学研究者、およびPLC属のレベッカ・クリッシャー博士に感謝したい。
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
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