Sığır Oositinde Mitokondriyal DNA'yı Azaltmak için Biseksiyon Kullanımı
Summary
Burada, bir sığır oositindeki mitokondriyal DNA kopya sayılarını önemli ölçüde azaltmak için bir protokol sunuyoruz (P < 0.0001). Bu yöntem, oosit mitokondrisini önemli ölçüde azaltmak için santrifüjleme ve biseksiyon kullanır ve yeniden yapılandırılmış türler arası somatik hücre nükleer transfer embriyolarında gelişme şansının artmasına izin verebilir.
Abstract
Türler arası somatik hücre nükleer transferi (iSCNT), nesli tükenmekte olan türleri kurtarmak için kullanılabilir, ancak yeniden yapılandırılmış embriyoda iki ayrı mitokondriyal DNA (mtDNA) popülasyonu bulunur: biri alıcı ooplazmasında ve diğeri donör somatik hücrede. Bu mitokondriyal heteroplazmi, embriyo ve fetüste gelişimsel sorunlara yol açabilir. El yapımı klonlama protokolleri, mtDNA kopya sayısını azaltmak için kullanılabilecek ve yeniden yapılandırılmış bir embriyodaki mitokondriyal heteroplazmi derecesini azaltan oosit biseksiyonunu içerir. Reddedilmiş, olgun sığır oositlerinin santrifüjlenmesi, yumurtanın bir kutbunda görünür bir mitokondri-yoğun fraksiyon üretti. Oositlerin zonae pellucidae’leri bir pronaz çözeltisine maruz bırakılarak çıkarıldı. Biseksiyon, görünür mitokondri fraksiyonunu çıkarmak için bir mikrobıçak kullanılarak gerçekleştirildi. qPCR, tüm oositlerden ve biseke edilmiş ooplastlardan ekstrakte edilen DNA örneklerinde bulunan mtDNA’yı ölçmek için kullanıldı ve biseksiyondan önce ve sonra mtDNA kopya sayılarının karşılaştırılmasını sağladı. Kopya sayıları, döngü eşik değerleri, standart bir eğrinin regresyon çizgisi formülü ve mtDNA PCR ürünlerinin ve genomik PCR ürünlerinin ilgili boyutlarını içeren bir oran kullanılarak hesaplandı. Bir sığır oositinin ortalama mtDNA kopya sayısı (± standart sapma) 137.904 ± 94.768 (n = 38) idi. Bir mitokondri tükenmiş ooplastın ortalama mtDNA kopya sayısı 8,442 ± 13,806’dır (n = 33). Mitokondri bakımından zengin bir ooplastta bulunan ortalama mtDNA kopyaları 79.390 ± 58.526 mtDNA kopyasıydı (n = 28). Bu hesaplanan ortalamalar arasındaki farklar, santrifüjleme ve müteakip biseksiyonun, orijinal oosit ile karşılaştırıldığında mitokondri tükenmiş ooplastta bulunan mtDNA kopya sayılarını önemli ölçüde azaltabileceğini göstermektedir (P < 0.0001, tek yönlü ANOVA tarafından belirlenir). mtDNA'daki azalma, yeniden yapılandırılmış bir embriyodaki mitokondriyal heteroplazmi derecesini azaltmalı ve muhtemelen standart embriyonik ve fetal gelişimi teşvik etmelidir. Somatik donör hücreden mitokondriyal ekstrakt ile takviye de başarılı embriyonik gelişim elde etmek için gerekli olabilir.
Introduction
Somatik hücre nükleer transferi (SCNT), bir hayvandan enüklee edilmiş bir oositin ve aynı türdeki bir hayvandan bir somatik hücrenin füzyonunu içerir. Çoğu durumda, oosit ve somatik hücre aynı türden kaynaklanır ve canlı doğum oranları %6’nın altındadır1. Bazı araştırmalar, iki farklı türden kaynaklanan somatik bir hücre ve oositin füzyonunu içeren türler arası SCNT’nin (iSCNT) kullanımını içerir. Bu çalışmalarda, canlı doğum oranları SCNT’den bile daha düşüktür – tipik olarak% 1’den azdır1. Bununla birlikte, iSCNT, nesli tükenmekte olan türleri kurtarma yöntemi olarak kullanılma kapasitesine sahiptir, çünkü bu hayvanlardan gelen somatik hücreler germ hücrelerinden daha erişilebilirdir1. iSCNT’de kullanılan alıcı oositler genellikle inekler, domuzlar ve fareler gibi evcil veya yaygın laboratuvar türleridir. Şimdiye kadar yapılan bazı girişimler başarılı bir şekilde canlı genç üretmişlerdir, ancak üretilen yavrular intrajenerik hayvanlar olmuştur (alıcı oosit türleri ve donör hücre türleri aynı cinsin üyeleriydi)2,3,4. Interjenerik modeller (farklı cinslerdeki hayvanlardan bir oosit ve somatik hücre kullanan) henüz canlı hayvanlar üretmemiştir ve yeniden yapılandırılmış embriyoların çoğu, in vitro gelişimin 8-16 hücre aşamasında tutuklanır 5,6,7,8. Bu embriyonik gelişimsel arrestin olası bir açıklaması, embriyolarda mitokondriyal heteroplazminin ortaya çıkmasıdır – tek bir hücrede birden fazla mitokondri DNA (mtDNA) tipinin varlığı. Heteroplazmi, embriyoda veya canlı hayvanda gelişimsel verimsizlik veya başarısızlık gibi sorunlara yol açabilir1. Patogenez, hayvanın yaşamının ilerleyen dönemlerinde de ortaya çıkabilir9. Bu sorun SCNT yavrularında da mevcut olmasına rağmen, iSCNT embriyolarındaki interspesifik bileşen sorunu daha da kötüleştirmektedir.
Embriyonik mtDNA iki farklı türden geldiğinde, çoğunluğu temsil eden alıcı oosit mitokondri, donör hücrenin çekirdeği1,10 ile verimli veya etkili bir şekilde çalışmaz. iSCNT’de kullanılan iki tür arasındaki daha büyük taksonomik boşluklar muhtemelen bu sorunu yoğunlaştırır; Üretilen intrajenerik canlı yavruların (Bos taurus oositleri kullanan Bos gaurus ve Bos indicus yavruları) yanı sıra geleneksel SCNT yoluyla üretilen yavruların (örneğin, Ovis koç oositleri kullanan Yumurtalık Koç yavruları) kimera olduğu gösterilmiştir (bu hayvanlarda iki kişiden mtDNAmevcuttu 11,12,13). Yine de, interjenerik SCNT embriyoları 14,15’ten çok daha fazla geliştiler. Oosit mitokondrisi ile donör hücrenin çekirdeği arasındaki bilgi alışverişi, intrajenerik embriyoda interjenerik embriyodan daha başarılı olabilir16.
Olgun bir sığır oositindeki mtDNA miktarı, bir somatik hücrede bulunan miktardan yaklaşık 100 kat daha fazladır12. Bu oranın azaltılması, somatik hücreli mitokondrinin yeniden yapılandırılmış embriyo içinde çoğalmasını teşvik edebilir ve daha büyük bir üretken mitokondri popülasyonunun bulunmasına izin verebilir16. Bu da gelişmekte olan embriyonun gereksinimlerini karşılamak için daha fazla enerji sağlayabilir15. Oosit veya embriyonun mtDNA kopya sayısını azaltmak için yapılan önceki girişimler arasında kimyasal uygulama, mikromanipülasyon ve yumurta veya embriyonun donör hücre türlerinden16,17,18,19,20 ek mitokondri ile takviye edilmesi yer almaktadır. Bununla birlikte, kimyasal uygulama (2′,3′-dideoksisitidin gibi) embriyonik gelişim için ideal değildir ve oosit mtDNA kopya sayılarını yaklaşık yarı yarıya18 oranında azaltmıştır. Mikromanipülasyon ile önceki oosit mtDNA indirgemesi, oositin mtDNA17’sinin sadece% 64’ünü çıkarmıştır. Donör hücre mitokondrisinin takviyesi uygulanabilir bir seçenek olsa da, kullanımı henüz iSCNT çalışmaları21’de canlı bir interjenerik hayvan üretmemiştir.
Oosit mtDNA kopya sayısını azaltmak için biseksiyon kullanımı henüz yayınlanmış çalışmalarda kullanılmamıştır. Ooblastları somatik bir hücre ile kaynaştırmak amacıyla oositlerin ikiye bölünmesi, tipik olarak polar cismi ve metafaz plakasını metafaz II (MII) oositinden çıkarma yöntemi olarak kullanılan el yapımı klonlamanın (HMC) öncülü. HMC, keçiler, sığırlar, domuzlar, koyunlar ve atlar22,23,24,25,26 dahil olmak üzere çeşitli türlerde başarıyla yavru üretmiştir, ancak tipik olarak biseksiyondan önce bir santrifüjleme adımı içermez. Yumurtanın yüksek hızlı santrifüjlenmesinin entegre edilmesi, oositin bir kutbunda mitokondrinin (ve dolayısıyla mtDNA’nın) izolasyonuna izin verir, bu da daha sonra bu mitokondri-yoğun fraksiyonları çıkarmak için bir mikrobıçak kullanılarak ikiye bölünebilir. İki mitokondri tükenmiş ooplast, HMC’de olduğu gibi, oosit türlerinden önemli ölçüde daha az mtDNA içeren yeniden yapılandırılmış bir embriyo oluşturmak için somatik bir hücre ile kaynaştırılabilir.
Bu protokolle cevaplamaya çalıştığımız soru, daha az heteroplazmik mtDNA içeren uygulanabilir bir yeniden yapılandırılmış embriyo üretmek için sığır oositindeki mtDNA’nın nasıl azaltılacağıdır. Bu protokolde oositler santrifüj edilmiş ve ikiye bölünmüştür. Ooplast ve bozulmamış oosit mtDNA kopya sayıları, bu tekniğin sığır oositinin mtDNA kopya sayısını azaltmadaki etkinliğini belirlemek için hesaplandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce oositlerde mtDNA kopya sayılarını azaltmak için kullanılan yöntemlerin dezavantajları vardır. Mitokondrilerin oositlerden mikromanipülasyon temelli uzaklaştırılması, mtDNA kopya sayılarını ortalama %64 oranında azaltır27. Daha önce enükleasyon için kullanılan benzersiz bir yöntem, küçük çaplı Pasteur pipetlerin kullanılmasını ve bir mikrodamla ortam ile çevresindeki mineral yağ arasındaki sınırda zona pellucida içermeyen bir oositin bölünmesini iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Utah Eyalet Üniversitesi’ndeki meslektaşlarına, San Diego Hayvanat Bahçesi’ndeki Üreme Bilimleri araştırmacılarına ve Genus PLC’deki Dr. Rebecca Krişer’e teşekkür etmek istiyor.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
