Uso de Bisection para reduzir DNA mitocondrial no Oócito Bovino

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para reduzir significativamente os números de cópia de DNA mitocondrial em um oócito bovino (P < 0,0001). Este método utiliza centrifugação e biseção para reduzir substancialmente mitocôndrias oócitos e pode permitir uma maior chance de desenvolvimento nos embriões de transferência nuclear de células somáticas de células somáticas reconstruídas.

Abstract

A transferência nuclear de células somáticas interespécies (iSCNT) pode ser usada para resgatar espécies ameaçadas de extinção, mas existem duas populações distintas de DNA mitocondrial (mtDNA) dentro do embrião reconstruído: uma dentro do ooplasma receptor e outra dentro da célula somática do doador. Essa heteroplasma mitocondrial pode levar a problemas de desenvolvimento no embrião e no feto. Protocolos de clonagem artesanal incluem biseção de oócito, que pode ser usada para diminuir o número de cópia de MTDNA, reduzindo o grau de heteroplasmia mitocondrial em um embrião reconstruído. Centrifugação de oócitos bovinos desnudos e maduros produziu uma fração visível mitocôndria-densa em um polo do oócito. A zonae pellucidae dos oócitos foi removida pela exposição a uma solução de pronase. A biseção foi realizada usando um microdílo para remover a fração de mitocôndrias visíveis. qPCR foi utilizado para quantificar o mtDNA presente em amostras de DNA extraídos de oócitos inteiros e ooplastos bisseccionados, proporcionando uma comparação dos números de cópias de MTDNA antes e depois da biseção. Os números de cópia foram calculados utilizando-se valores de limiar de ciclo, fórmula de linha de regressão de uma curva padrão e uma razão que incluía os respectivos tamanhos de produtos DE PCR mtDNA e produtos PCR genômicos. Um oócito bovino tinha um número médio de cópia mtDNA (± desvio padrão) de 137.904 ± 94.768 (n = 38). Um ooplasto empobrecido por mitocôndrias tinha um número médio de cópia mtDNA de 8.442 ± 13.806 (n = 33). As cópias médias de mtDNA presentes em um ooplasto rico em mitocôndrias foram de 79.390 ± 58.526 cópias mtDNA (n = 28). As diferenças entre essas médias calculadas indicam que a centrifugação e a biseção subsequente podem diminuir significativamente os números de cópias de MTDNA presentes no ooplasto empobrecido por mitocôndrias quando comparado com o oócito original (P < 0,0001, determinado pela ANOVA unidirecional). A redução do dNH deve diminuir o grau de heteroplasmia mitocondrial em um embrião reconstruído, possivelmente promovendo o desenvolvimento embrionário e fetal padrão. A suplementação com extrato mitocondrial da célula doador somática também pode ser essencial para alcançar o desenvolvimento embrionário bem sucedido.

Introduction

A transferência nuclear de células somáticas (SCNT) inclui a fusão de um oócito enucleado de um animal e uma célula somática de um animal da mesma espécie. Na maioria dos casos, o oócito e a célula somática são originários da mesma espécie, e as taxas de natalidade viva estão abaixo de 6%¹. Algumas pesquisas envolvem o uso de interespécies SCNT (iSCNT), que inclui a fusão de uma célula somática e oócito que se originam de duas espécies diferentes. Nesses estudos, as taxas de natalidade ao vivo são ainda menores do que no SCNT- tipicamente inferior a 1%¹. No entanto, o iSCNT tem a capacidade de ser usado como método de resgate de espécies ameaçadas de extinção, uma vez que as células somáticas desses animais são mais acessíveis do que suas células germinativas¹. Os oócitos receptores usados no iSCNT são frequentemente espécies domésticas ou comuns de laboratório, como vacas, suínos e camundongos. Algumas tentativas feitas até agora produziram com sucesso jovens vivos, embora os filhotes produzidos tenham sido animais intrageníricos (as espécies de oócitos receptores e espécies de células doadoras eram membros do mesmo gênero)^2,3,4. Os modelos intergênicos (que utilizam uma célula oótil e somática de animais em diferentes gêneros) ainda não produziram animais vivos, e a maioria dos embriões reconstruídos prende no estágio 8-16 de desenvolvimento in vitro ^5,6,7,8. Uma possível explicação para essa parada embrionária de desenvolvimento é a ocorrência de heteroplasmia mitocondrial nos embriões – a presença de mais de um tipo de DNA mitocôndria (mtDNA) em uma única célula. A heteroplasma pode levar a questões como ineficiência do desenvolvimento ou falha no embrião ou no animal vivo¹. A patogênese também pode ocorrer mais tarde na vida^{do animal 9}. Embora esta questão também esteja presente na prole do SCNT, o componente interespecífico dentro dos embriões iSCNT agrava a questão.

Quando o mtDNA embrionário vem de duas espécies diferentes, as mitocôndrias oócitos receptoras, que representam a maioria, não funcionam de forma eficiente ou eficaz com o núcleo ^1,10 da célula doadora. Maiores lacunas taxonômicas entre as duas espécies utilizadas no iSCNT provavelmente intensificam esse problema; descendentes vivos intragênicos produzidos (bos gaurus e bos indicus prole usando oócitos de Bos taurus), bem como descendentes produzidos através do TRADICIONAL SCNT (por exemplo, ovis aries prole usando oócitos Ovis aries) foram mostrados como quimeras (mtDNA de dois indivíduos estava presente nestes animais 11,12,13). No entanto, eles se desenvolveram muito mais do que os embriões SCNT intergênicos^14,15. A troca de informações entre as mitocôndrias oócitos e o núcleo da célula doadora poderia ser mais bem sucedida no embrião intragênico do que no embrião intergênico¹⁶.

A quantidade de dN em um oócito bovino maduro é aproximadamente 100 vezes maior do que a quantidade encontrada em uma célula somática¹². A redução dessa proporção poderia incentivar a proliferação das mitocôndrias celulares somáticas dentro do embrião reconstruído, permitindo que uma maior população de mitocôndrias produtivas esteja presente¹⁶. Isso poderia, por sua vez, fornecer mais energia para atender aos requisitos do embrião^{em desenvolvimento 15}. Tentativas anteriores feitas para reduzir o número de cópia de mtDNA do oócito ou embrião incluem aplicação química, micromanipulação e suplementação do oócito ou embrião com mitocôndrias adicionais da espécie celular doadora 16,17,18,19,20. No entanto, a aplicação química (como 2′,3′-dideoxycytidine) não é ideal para o desenvolvimento embrionário, e reduziu os números de cópias de oócito mtDNA em aproximadamente metade^{de 18}. A redução de oócitos anteriores por micromanipulação só removeu uma média de 64% do mtDNA¹⁷ do oócito. Embora a suplementação de mitocôndrias de células doadoras possa ser uma opção viável, seu uso ainda não produziu um animal intergenérico vivo dentro dos estudos do iSCNT²¹.

O uso de biseção para reduzir o número de cópia oócito mtDNA ainda não foi utilizado em estudos publicados. Bissectar oócitos com a intenção de fundir os ooplastos com uma célula somática é a premissa da clonagem artesanal (HMC), que normalmente utiliza biseção como método de remoção do corpo polar e placa de metafase do oócito metafase II (MII). O HMC produziu com sucesso descendentes em várias espécies, incluindo cabras, bovinos, suínos, ovinos e cavalos 22,23,24,25,26, mas normalmente não inclui um passo de centrifugação antes da biseção. A integração da centrífuga de alta velocidade do oócito permite o isolamento das mitocôndrias (e, portanto, mtDNA) em um polo do oócito, que pode então ser bissecto usando um microblade para remover essas frações mitocondria-densas. Dois ooplastos empobrecidos mitocôndrias podem então ser fundidos com uma célula somática, como é o caso do HMC, para formar um embrião reconstruído que contém consideravelmente menos mtDNA da espécie oócteto.

A pergunta que tentamos responder com este protocolo é como reduzir o dNM no oócito bovino, a fim de produzir um embrião reconstruído viável que contenha mtDNA menos heteroplasmica. Neste protocolo, os oócitos foram centrifudos e bisseccionados. Os números de cópias ooplastia e ooplasta ooplasta mtDNA foram calculados para determinar a eficácia desta técnica na redução do número de cópia mtDNA do oocito bovino.

Protocol

O seguinte protocolo segue as diretrizes de cuidado e ética dos animais fornecidas pela Universidade Estadual de Utah. 1. Preparação da mídia Antes do manuseio de oócitos, prepare as seguintes soluções, conforme descrito na Tabela 1: 400 μL da Solução Hyaluronidase, 500 μL de mídia T2, 1.020 μL de mídia T20 e 800 μL de mídia T10. Divida a mídia T10 em dois poços de uma placa de quatro poços, 400 μL por poço. Rotule um b…

Representative Results

Os resultados quantitativos de PCR (qPCR) são utilizados para determinar as quantidades relativas de mtDNA presentes em cada ooplasto. A reação descrita foi projetada para amplificar a região 12S do mtDNA bovino. Se a biseção foi bem sucedida, as amostras de oócitos inteiros e ooplastos mitocôndrias-densas terão valores Ct semelhantes. As amostras de ooplastos reduzidos por mitocôndrias terão valores Ct mais elevados quando comparadas com as amostras dos outros…

Discussion

Métodos anteriormente utilizados para diminuir o número de cópias de MTDNA em oócitos têm suas respectivas desvantagens. A remoção baseada em micromanipulação de mitocôndrias de oócitos diminui os números de cópias de MTDNA em uma média de 64%²⁷. Um método único, anteriormente utilizado para a enucleação, envolve o uso de pipetas Pasteur de pequeno diâmetro e a divisão de um oócito zona pellucida na fronteira entre uma microdrop de mídia e o óleo mineral circundante. Juntame…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage