Anvendelse af bisection til at reducere mitokondrie-DNA i bovine oocyte

Summary

Her præsenterer vi en protokol for signifikant at reducere mitokondrie-DNA-kopinumrene i en bovin oocyt (P < 0,0001). Denne metode anvender centrifugering og bisektion til væsentligt at reducere oocyt mitokondrier og kan give mulighed for en øget chance for udvikling i de rekonstruerede interspecies somatiske celle nukleare overførselsembryoner.

Abstract

Interspecies somatisk celle nuklear overførsel (iSCNT) kan bruges til at redde truede arter, men der findes to forskellige populationer af mitokondrie-DNA (mtDNA) i det rekonstruerede embryo: en inden for recipient-ooplasmaet og en inden for donorens somatiske celle. Denne mitokondrie heteroplasma kan føre til udviklingsproblemer i embryoet og fosteret. Håndlavede kloningsprotokoller inkluderer oocytbisektion, som kan bruges til at reducere mtDNA-kopinummeret, hvilket reducerer graden af mitokondrie-heteroplasma i et rekonstrueret embryo. Centrifugering af denuderede, modne bovinoocytter frembragte en synlig mitokondri-tæt fraktion ved en pol af oocyten. Oocytternes zonae pellucidae blev fjernet ved eksponering for en pronaseopløsning. Bisection blev udført ved hjælp af en mikroblade for at fjerne den synlige mitokondrierfraktion. qPCR blev brugt til at kvantificere mtDNA til stede i DNA-prøver ekstraheret fra hele oocytter og gennemskårne ooplaster, hvilket giver en sammenligning af mtDNA-kopinumre før og efter bisektion. Kopinumre blev beregnet ved hjælp af cyklustærskelværdier, en standardkurves regressionslinjeformel og et forhold, der omfattede de respektive størrelser af mtDNA PCR-produkter og genomiske PCR-produkter. En kvægoocyt havde et gennemsnitligt mtDNA-kopinummer (± standardafvigelse) på 137.904 ± 94.768 (n = 38). En mitokondrier-udtømt ooplast havde et gennemsnitligt mtDNA-kopinummer på 8.442 ± 13.806 (n = 33). Gennemsnitlige mtDNA-kopier til stede i en mitokondri-rig ooplast var 79.390 ± 58.526 mtDNA-kopier (n = 28). Forskellene mellem disse beregnede gennemsnit indikerer, at centrifugeringen og den efterfølgende bisektion signifikant kan reducere mtDNA-kopinumrene, der er til stede i den mitokondri-udtømte ooplast sammenlignet med den oprindelige oocyt (P < 0,0001, bestemt af envejs ANOVA). Reduktionen i mtDNA bør nedsætte graden af mitokondrieheteroplasma i et rekonstrueret embryon, hvilket muligvis fremmer standard embryonal og føtal udvikling. Tilskud med mitokondrieekstrakt fra den somatiske donorcelle kan også være afgørende for at opnå en vellykket embryonal udvikling.

Introduction

Somatisk cellekerneoverførsel (SCNT) omfatter fusion af en enukleeret oocyt fra et dyr og en somatisk celle fra et dyr af samme art. I de fleste tilfælde stammer oocyten og den somatiske celle fra samme art, og levende fødselsrater er under 6%¹. Nogle undersøgelser involverer brugen af interspecies SCNT (iSCNT), som omfatter fusion af en somatisk celle og oocyt, der stammer fra to forskellige arter. I disse undersøgelser er levende fødselsrater endnu lavere end i SCNT – typisk mindre end 1%¹. iSCNT har imidlertid kapacitet til at blive brugt som en metode til redning af truede arter, da somatiske celler fra disse dyr er mere tilgængelige end deres kimceller¹. Modtageroocytter, der anvendes i iSCNT, er ofte indenlandske eller almindelige laboratoriearter, såsom køer, svin og mus. Nogle forsøg hidtil har med succes produceret levende unger, selvom de producerede afkom har været intrageneriske dyr (recipient-oocytarterne og donorcellearterne var medlemmer af samme slægt)^2,3,4. Intergeneriske modeller (som anvender en oocyt og somatisk celle fra dyr i forskellige slægter) har endnu ikke produceret levende dyr, og størstedelen af rekonstruerede embryoner arresteres på 8-16 cellestadiet af in vitro-udvikling 5,6,7,8. En mulig forklaring på denne embryonale udviklingsstop er forekomsten af mitokondrieheteroplasma i embryonerne – tilstedeværelsen af mere end en mitokondri-DNA-type (mtDNA) i en enkelt celle. Heteroplasma kan føre til problemer som udviklingsmæssig ineffektivitet eller svigt i embryoet eller i det levende dyr¹. Patogenese kan også forekomme senere i dyrets levetid⁹. Selvom dette problem også er til stede i SCNT-afkom, forværrer den interspecifikke komponent i iSCNT-embryoner problemet.

Når den embryonale mtDNA kommer fra to forskellige arter, fungerer recipienten oocyt mitokondrier, som repræsenterer flertallet, ikke effektivt med donorcellens kerne ^1,10. Større taksonomiske huller mellem de to arter, der anvendes i iSCNT, intensiverer sandsynligvis dette problem; intrageneriske levende afkom produceret (Bos gaurus og Bos indicus afkom ved hjælp af Bos taurus oocytter) samt afkom produceret via traditionel SCNT (f.eks. Ovis aries afkom ved hjælp af Ovis aries oocytter) viste sig at være kimærer (mtDNA fra to individer var til stede i disse dyr 11,12,13). Alligevel udviklede de sig meget længere end de intergeneriske SCNT-embryoner ^14,15. Udvekslingen af oplysninger mellem oocyt mitokondrierne og donorcellens kerne kan være mere vellykket i det intrageneriske embryo end i det intergeneriske embryo¹⁶.

Mængden af mtDNA i en moden bovin oocyt er ca. 100 gange større end den mængde, der findes i en somatisk celle¹². Reduktion af dette forhold kan tilskynde de somatiske celle mitokondrier til at sprede sig i det rekonstruerede embryo, hvilket gør det muligt for en større population af produktive mitokondrier at være til stede¹⁶. Dette kan igen give mere energi til at opfylde kravene i det udviklende embryo¹⁵. Tidligere forsøg på at reducere mtDNA-kopinummeret af oocyten eller embryoet inkluderer kemisk anvendelse, mikromanipulation og supplering af oocyten eller embryoet med yderligere mitokondrier fra donorcellearten 16,17,18,19,20. Imidlertid er kemisk anvendelse (såsom 2′,3′-dideoxycytidin) ikke ideel til embryonal udvikling og har reduceret oocyt mtDNA-kopinumre med ca. halvdelen¹⁸. Tidligere oocyt mtDNA reduktion ved mikromanipulation har kun fjernet et gennemsnit på 64% af oocytens mtDNA¹⁷. Selvom tilskud af donorcelle mitokondrier kunne være en levedygtig mulighed, har dets anvendelse endnu ikke produceret et levende intergenerisk dyr inden for iSCNT-undersøgelser²¹.

Brugen af bisection til at reducere oocyt mtDNA kopi nummer er endnu ikke blevet brugt i offentliggjorte undersøgelser. Bisecting oocytter med det formål at fusionere ooplasterne med en somatisk celle er forudsætningen for håndlavet kloning (HMC), som typisk bruger bisection som metode til at fjerne polarlegemet og metafasepladen fra metafase II (MII) oocyten. HMC har med succes produceret afkom i flere arter, herunder geder, kvæg, svin, får og heste 22,23,24,25,26, men inkluderer typisk ikke et centrifugeringstrin før bisektion. Integrering af højhastighedscentrifugering af oocyten muliggør isolering af mitokondrier (og derfor mtDNA) ved en pol af oocyten, som derefter kan gennemskæres ved hjælp af et mikroblad for at fjerne disse mitokondri-tætte fraktioner. To mitokondrier-udtømte ooplaster kan derefter smeltes sammen med en somatisk celle, som det er tilfældet i HMC, for at danne et rekonstrueret embryo, der indeholder betydeligt mindre mtDNA fra oocytarterne.

Det spørgsmål, vi forsøger at besvare med denne protokol, er, hvordan man reducerer mtDNA i kvægoocyten for at producere et levedygtigt rekonstrueret embryo, der indeholder mindre heteroplasmisk mtDNA. I denne protokol blev oocytter centrifugeret og gennemskåret. Ooplast og intakte oocyt mtDNA-kopinumre blev beregnet for at bestemme effektiviteten af denne teknik til at reducere kvægoocytens mtDNA-kopinummer.

Protocol

Følgende protokol følger retningslinjerne for dyrepleje og etik fra Utah State University. 1. Forberedelse af medier Før håndtering af oocyt fremstilles følgende opløsninger som beskrevet i tabel 1: 400 μL Hyaluronidase-opløsning, 500 μL T2-medier, 1.020 μL T20-medier og 800 μL T10-medier. Opdel T10-mediet i to brønde af en fire-brøndplade, 400 μL pr. Brønd. Mærk en brønd med “M” og den anden brønd med “MR”. Anbring i en 5…

Representative Results

Kvantitative PCR (qPCR) resultater anvendes til at bestemme de relative mængder mtDNA til stede i hver ooplast. Den beskrevne reaktion er designet til at forstærke 12S-regionen af bovin mtDNA. Hvis bisektionen var vellykket, vil prøverne fra hele oocytter og mitokondri-tætte ooplaster have lignende Ct-værdier . Prøverne fra mitokondriereducerede ooplaster vil have højere Ct-værdier sammenlignet med prøverne fra de to andre grupper. En Ct graf , der vis…

Discussion

Metoder, der tidligere blev brugt til at reducere mtDNA-kopinumre i oocytter, har deres respektive ulemper. Mikromanipulationsbaseret fjernelse af mitokondrier fra oocytter reducerer mtDNA-kopinumre med et gennemsnit på 64%²⁷. En unik metode, der tidligere blev brugt til enukleation, involverer anvendelse af Pasteur-pipetter med lille diameter og opdeling af en zona pellucida-fri oocyt ved grænsen mellem en mikrodråbe af medier og den omgivende mineralolie. Sammen med brugen af oocytcentrifuger…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage