JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Kombination af 3D magnetisk kraftaktuator og multifunktionel fluorescensbilleddannelse for at studere kernemekanobiologi

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
, , , , , , , , ,
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Denne undersøgelse præsenterer en ny protokol til direkte at anvende mekanisk kraft på cellekernen gennem magnetiske mikroperler leveret ind i cytoplasmaet og til at udføre samtidig levende celle fluorescerende billeddannelse.

Abstract

Et grundlæggende spørgsmål i mekanobiologi er, hvordan levende celler sanser ekstracellulære mekaniske stimuli i forbindelse med cellefysiologi og patologi. Den cellulære mekano-fornemmelse af ekstracellulære mekaniske stimuli menes at være gennem membranreceptorerne, det tilknyttede proteinkompleks og cytoskelettet. Nylige fremskridt inden for mekanobiologi viser, at cellekernen i cytoplasma selv uafhængigt kan mærke mekaniske stimuli samtidigt. Imidlertid mangler en mekanistisk forståelse af, hvordan cellekernen sanser, transducerer og reagerer på mekaniske stimuli, hovedsageligt på grund af de tekniske udfordringer med at få adgang til og kvantificere kernemekanikken ved hjælp af konventionelle værktøjer. Dette papir beskriver design, fremstilling og implementering af en ny magnetisk kraftaktuator, der anvender præcise og ikke-invasive 3D mekaniske stimuli til direkte deformering af cellekernen. Ved hjælp af CRISPR /Cas9-manipulerede celler viser denne undersøgelse, at dette værktøj kombineret med højopløselig konfokal fluorescerende billeddannelse muliggør afsløring af realtidsdynamikken i et mekano-følsomt ja-associeret protein (YAP) i enkeltceller som en funktion af kernedeformation. Denne enkle metode har potentialet til at bygge bro over det nuværende teknologigab i mekanobiologisamfundet og give svar på den videnskløft, der findes i forholdet mellem kernemekanotransduktion og cellefunktion.

Introduction

Denne undersøgelse sigter mod at udvikle og anvende en ny teknik til at belyse kernemekanobiologi ved at kombinere de magnetiske aktuatorer, der anvender mekanisk kraft direkte på cellekernen og den konfokale fluorescensmikroskopi, der samtidig afbilder de strukturelle og funktionelle subcellulære ændringer. Celler registrerer ekstracellulære biofysiske signaler, herunder vævsstivhed 1,2,3,4, interstitiel væsketryk og forskydningsspænding 5,6,7, overfladetopologi/geometri 8,9,10,11,12 og spændings-/kompressionsspænding13,14, 15,16. Biofysiske signaler omdannes til biokemiske signaler og udløser potentielle nedstrøms ændringer af genekspression og celleadfærd – en proces kendt som mekanotransduktion 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . For at studere mekanotransduktionsprocesser er der udviklet et utal af teknikker til at anvende mekanisk kraft på cellerne, såsom atomkraftmikroskopi28, cellestrækningsenhed29, bio-MEMS (mikroelektromekaniske systemer) kraftsensor 15,30,31, forskydningsreologi 32 og Stereo Vision System 33 . En nylig gennemgang opsummerer tilgangene til at anvende ekstracellulære mekaniske signaler og forstyrre mekanosensing34. Til dato anvender de fleste af disse metoder kraft på celleplasmamembranen, og celler modtager direkte disse ekstracellulære biofysiske signaler via membranreceptorer såsom integrin, cadherin, ionkanaler og G-proteinkoblede receptorer. Derefter sender de signalet til det intracellulære cytoskelet og kernen. For eksempel ved hjælp af ja-associeret protein (YAP) translokation som en indikator for mekano-sensing, viser celler at fornemme de mekaniske signaler af substratstivhed og ekstracellulær spænding fra cellemembranen og transmittere dem gennem cytoskelettet ind i kernen for at inducere YAP-cytoplasma-til-kernetranslokation28,35.

Nylige beviser tyder på, at selve cellekernen er en uafhængig mekano-sensor 8,36,37. Dette er bevist ved eksperimenter udført på den isolerede kerne høstet fra celler, hvor det blev afsløret, at kerner adaptivt ændrer deres stivhed som reaktion på den mekaniske kraft, der påføres demdirekte 36. Under mange fysiologiske tilstande fornemmer kerner i både tumor og sunde celler ekstracellulære biofysiske signaler og ændrer deres mekaniske egenskaber og samlinger38,39,40. For eksempel ved ekstravasation falder tumorcellernes nukleare stivhed og opretholder blødhed i over 24 timer38. Under migration gennem begrænset interstitielt rum mister kernerne i tumorceller ofte og genvinder deres strukturelle integritet39. Den måde, hvorpå kernen registrerer det biofysiske signal, er imidlertid ukendt, selvom flere nukleare kuvertproteiner og familier af proteiner har vist sig at være involveret, såsom Lamin A / C og linker af nukleoskelet og cytoskelet (LINC) kompleks38,41. Derfor vil nye ikke-invasive metoder, der direkte kan anvende kraft på kernen, afkoble effekten af kraftoverførsel fra celle-plasmamembranen og cytoskelettet og vil hjælpe med at belyse de tidligere utilgængelige molekylære mekanismer for nuklear mekano-sensing.

Forskning, der anvendte optisk pincet til at manipulere organeller42 og mikroperler injiceret i celler43, viste den teknologiske evne til direkte at anvende kraft på kernen. Den optiske pincetteknik har imidlertid flere begrænsninger: (1) optiske pincet med lav kapacitet manipulerer ofte kun en celle eller mikrokugle ad gangen; og (2) potentiel fotoskade og temperaturartefaktdeformation af atomkraft kræver snesevis af pN36, og den tilsvarende nødvendige lasereffekt er ca. 10 mW pr. pN44,45. En sådan laserintensitet er tilstrækkelig til at udløse fotoskader i cellerne og forstyrre cellefunktionerne under eksperimentet46.

Magnetisk kraft påført gennem mikroperler i levende celler viser potentialet til direkte at anvende kraft på kernen og overvinde begrænsningerne ved optisk pincet. Når mikroperler er leveret ind i cytoplasmaet, kan et magnetfelt udøve en magnetisk kraft på flere mikroperler samtidigt på en måde med høj kapacitet. Magnetfeltet påvirker ikke cellefunktioner47, men genererer kraft fra pN til nN, hvilket er nok til at inducere nuklear deformation 36,48,49. Hidtil er manipulation af magnetiske mikroperler blevet anvendt på celleplasmamembran48, inde i cytoplasma50, på F-actin51, inde i kernen47 og på den isolerede kerne36. Imidlertid er magnetisk manipulation af mikroperler aldrig blevet brugt til at anvende direkte mekanisk kraft på atomkuverten for at studere mekanotransduktion i kernen.

I dette papir udvikles en simpel teknik til ikke-invasivt at levere magnetiske mikroperler ind i cytoplasmaet og bruge disse mikroperler til at anvende mekanisk kraft på kernen (figur 1). Her bruges CRISPR/Cas9-konstruerede menneskelige normale B2B-cellelinjer, der endogent udtrykker mNeonGreen21-10/11-mærket YAP, til at validere metoden. YAP er et mekanofølsomt protein, og translokationen af YAP reguleres af nuklear mekano-sensing14,28. Den CRISPR/Cas9-regulerede knock-in-tilgang blev valgt til at mærke endogen YAP med et fluorescerende protein (FP) mNeonGreen21-10/11. Selvom CRISPR-redigering er kendt for at have ufuldstændig effektivitet og off-target effekt, integrerede protokollerne i tidligere publikationer fluorescenssortering for at vælge korrekt åben læserammeindsættelse52,53,54. Med dette ekstra selektionslag blev der ikke observeret nogen tagginghændelse uden for målet i 20+ cellelinjer, der tidligere genererede52,53,54,55. Dette er en delt fluorescerende proteinkonstruktion, men i princippet kan ethvert udtryksfuldt fluorescerende mærke være brugbart. Denne mærkningsmetode er bedre end transgene eller antistofmetoder. For det første, i modsætning til transgenekspressionen, opretholder det mærkede protein enkeltkopi-gendosering og udtrykker sig i den fysiologiske sammenhæng med det native genregulerende netværk, hvilket begrænser afvigelser i proteinkoncentration, lokalisering og interaktion. Mærkningsmetoden, der anvendes i denne undersøgelse, opnår over en størrelsesorden højere gennemstrømning og effektivitet end fuld FP-mærkning. Det undgår også udfordringer forbundet med immunfluorescens på grund af fikseringsartefakter og den begrænsede tilgængelighed af antistoffer af høj kvalitet og høj specificitet. For det andet gør den tilgang, der anvendes i dette papir, minimal forstyrrelse af cellefysiologien og muliggør realtidsåbenbaring af alle endogene YAP’er autentisk. I modsætning hertil fører andre almindelige transgene metoder ofte til overekspression af YAP. Den resulterende kunstige fordeling kan potentielt forårsage cytotoksicitet og påvirke mekano-sensing af celler56,57,58.

Denne undersøgelse præsenterer en protokol til direkte at anvende kraft på kernen gennem magnetiske mikroperler leveret ind i cytoplasmaet og til at udføre samtidig levende celle fluorescerende billeddannelse. Sammenfattende viser de protokoller, der præsenteres her, hvordan man (1) leverer magnetiske mikroperler ind i cellen, mens de er uden for kernen, (2) manipulerer mikroperlerne til at anvende magnetisk kraft på kernen, (3) udfører konfokal fluorescerende billeddannelse af cellerne under manipulation og (4) kvantitativt analyserer YAP-nuklear / cytoplasma (N / C) -forholdet gennem kraftpåføringsprocessen. Resultaterne tyder på, at (1) gennem endocytose kan magnetiske mikroperler ikke-invasivt leveres til cytoplasmaet af B2B-celler inden for 7 timer (figur 2 og figur 3); og (2) kvantificeret magnetisk kraft, der påføres direkte på kernen (figur 4, figur 5 og figur 6) alene kan udløse forskellige ændringer i YAP N / C-forhold i CRISPR / Cas9-konstruerede B2B-celler (figur 7 og figur 8).

Protocol

1. Vedligeholdelse af CRISPR/Cas9-konstruerede B2B-celler Kultur B2B-celler i en T25-kolbe med RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. B2B-cellerne opbevares i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Subkulturer B2B-cellerne, når sammenløbet når 70% til 80%. Opbevar B2B-cellelinjen i RPMI-1640 dyrkningsmedium med 10% (v/v) DMSO i en -80 °C fryser. Brug B2B-cellerne med et passagenummer mindre en…

Representative Results

Design af en magnetbevægelsesanordning og anvendelse af magnetisk kraftFor at anvende kraft på kernen gennem de magnetiske mikroperler blev en magnetbevægelsesanordning designet og bygget til at styre magnetens rumlige position. Magnetbevægelsesenheden indeholder en central ramme, tre knapper og skinner til at flytte den vedhæftede magnet i x-, y- og z-retninger uafhængigt ved den rumlige opløsning på 1,59 mm pr. cyklus (figur 1A). Når magneten er flyttet tæt p…

Discussion

Internalisering af magnetiske mikroperler (afsnit 2.2) er kritisk, fordi ekstracellulære mikroperler ikke kan anvende kraft direkte på kernen. Kraftanvendelse og billeddannelse (afsnit 5.3) er kritiske trin i dette eksperiment, og den kraft, der er nødvendig for at deformere kernen og fremkalde meningsfulde biologiske konsekvenser, kan være prøveafhængig. Kraftstørrelsen i dette eksperiment (0,8 nN og 1,4 nN) kan øges yderligere for at udløse nuklear mekano-sensing i mindre følsomme celler.

<p class="jove_c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette projekt er finansieret af UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. og Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) og UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Vi sætter stor pris på de intellektuelle diskussioner med og den tekniske støtte fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurokirurgi), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institut for Kvantitative Systemer Farmakologi), Dr. David Hahn (University of Arizona), og supportteam af Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Vi er dybt taknemmelige for den effektive støtte fra alle medlemmer af Tangs, Yamaguchis, Sharmas, Au’s, Siemanns og Guans forskningslaboratorier og alle medarbejdere i UF MAE Department.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in ‘omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -. F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

3D Magnetic Force ActuatorMulti-functional Fluorescence ImagingNucleus MechanobiologyMagnetic MicrobeadsCell InternalizationConfocal Fluorescence ImagingLive-cell ImagingNuclear StainYES-associated Protein (YAP)Cell BoundaryCytoskeletonOptical TweezersCell FunctionsHigh Throughput
check_url/64098?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image