JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Combinaison d’un actionneur de force magnétique 3D et d’une imagerie par fluorescence multifonctionnelle pour étudier la mécanobiologie du noyau

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
, , , , , , , , ,
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Cette étude présente un nouveau protocole pour appliquer directement une force mécanique sur le noyau cellulaire par le biais de microbilles magnétiques livrées dans le cytoplasme et pour effectuer simultanément l’imagerie fluorescente de cellules vivantes.

Abstract

Une question fondamentale en mécanobiologie est de savoir comment les cellules vivantes perçoivent les stimuli mécaniques extracellulaires dans le contexte de la physiologie et de la pathologie cellulaires. On pense que la mécano-sensation cellulaire des stimuli mécaniques extracellulaires se fait à travers les récepteurs membranaires, le complexe protéique associé et le cytosquelette. Les progrès récents de la mécanobiologie démontrent que le noyau cellulaire du cytoplasme lui-même peut détecter indépendamment simultanément les stimuli mécaniques. Cependant, une compréhension mécaniste de la façon dont le noyau cellulaire détecte, transduit et répond aux stimuli mécaniques fait défaut, principalement en raison des défis techniques liés à l’accès et à la quantification de la mécanique du noyau par des outils conventionnels. Cet article décrit la conception, la fabrication et la mise en œuvre d’un nouvel actionneur de force magnétique qui applique des stimuli mécaniques 3D précis et non invasifs pour déformer directement le noyau cellulaire. En utilisant des cellules modifiées par CRISPR/Cas9, cette étude démontre que cet outil, combiné à l’imagerie confocale fluorescente à haute résolution, permet la révélation de la dynamique en temps réel d’une protéine associée oui (YAP) mécano-sensible dans des cellules individuelles en fonction de la déformation du noyau. Cette méthode simple a le potentiel de combler le fossé technologique actuel dans la communauté de la mécanobiologie et de fournir des réponses au manque de connaissances qui existe dans la relation entre la mécanotransduction du noyau et la fonction cellulaire.

Introduction

Cette étude vise à développer et à appliquer une nouvelle technique pour élucider la mécanobiologie du noyau en combinant les actionneurs magnétiques qui appliquent une force mécanique directement sur le noyau cellulaire et la microscopie confocale à fluorescence qui imagera simultanément les changements subcellulaires structurels et fonctionnels. Les cellules détectent les signaux biophysiques extracellulaires, y compris la rigidité tissulaire 1,2,3,4, la pression du fluide interstitiel et la contrainte de cisaillement 5,6,7, la topologie/géométrie de surface 8,9,10,11,12 et la contrainte de tension/compression13,14, 15,16. Les signaux biophysiques sont convertis en signaux biochimiques et déclenchent des changements potentiels en aval de l’expression génique et des comportements cellulaires – un processus connu sous le nom de mécanotransduction 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Pour étudier les processus de mécanotransduction, une myriade de techniques ont été développées pour appliquer une force mécanique sur les cellules, telles que la microscopie à force atomique28, le dispositif d’étirement cellulaire29, le capteur de force bio-MEMS (systèmes micro-électromécaniques) 15,30,31, la rhéologie de cisaillement 32 et le système de vision stéréoscopique 33 . Une revue récente résume les approches pour appliquer des signaux mécaniques extracellulaires et interférer avec la mécanodétection34. À ce jour, la plupart de ces méthodes appliquent une force sur la membrane plasmique cellulaire, et les cellules reçoivent directement ces signaux biophysiques extracellulaires via des récepteurs membranaires tels que l’intégrine, la cadhérine, les canaux ioniques et les récepteurs couplés aux protéines G. Par la suite, ils transmettent le signal au cytosquelette intracellulaire et au noyau. Par exemple, en utilisant la translocation de protéines associées à l’oui (YAP) comme indicateur de mécano-détection, il est démontré que les cellules détectent les signaux mécaniques de rigidité du substrat et de tension extracellulaire de la membrane cellulaire et les transmettent à travers le cytosquelette dans le noyau pour induire la translocation du cytoplasme au noyauYAP 28,35.

Des preuves récentes suggèrent que le noyau cellulaire lui-même est un mécano-capteur indépendant 8,36,37. Ceci est prouvé par des expériences effectuées sur le noyau isolé prélevé sur des cellules, où il a été révélé que les noyaux modifient adaptativement leur rigidité en réponse à la force mécanique directement appliquée sur eux36. Au cours de nombreuses conditions physiologiques, les noyaux des cellules tumorales et saines détectent les signaux biophysiques extracellulaires et modifient leurs propriétés mécaniques et leurs assemblages38,39,40. Par exemple, lors de l’extravasation, la rigidité nucléaire des cellules tumorales diminue et maintient la douceur pendant plus de 24 h38. Au cours de la migration à travers l’espace interstitiel confiné, les noyaux des cellules tumorales perdent fréquemment et retrouvent leur intégrité structurelle39. Cependant, la façon dont le noyau détecte le signal biophysique est inconnue, bien que plusieurs protéines d’enveloppe nucléaire et familles de protéines se soient révélées impliquées, telles que Lamin A / C et linker of nucleoskeleton and cytoskeleton complex (LINC)38,41. Par conséquent, de nouvelles méthodes non invasives capables d’appliquer directement une force au noyau découpleront l’effet de la transmission de la force de la membrane cellule-plasma et du cytosquelette, et aideront à élucider les mécanismes moléculaires auparavant inaccessibles de la mécano-détection nucléaire.

Les recherches utilisant des pincettes optiques pour manipuler les organites42 et les microbilles injectées dans les cellules43 ont montré la capacité technologique d’appliquer directement une force sur le noyau. Cependant, la technique de la pince optique présente plusieurs limites : (1) les pinces optiques à faible débit ne manipulent souvent qu’une seule cellule ou microbille à la fois; et (2) les photodommages potentiels et la déformation des artefacts de température du nucléaire nécessitent des dizaines de pN36, et la puissance laser nécessaire correspondante est d’environ 10 mW par pN44,45. Une telle intensité laser est suffisante pour déclencher des photodommages dans les cellules et perturber les fonctions cellulaires au cours de l’expérience46.

La force magnétique appliquée à travers les microbilles dans les cellules vivantes montre le potentiel d’appliquer directement une force sur le noyau et surmonte les limites des pincettes optiques. Une fois que les microbilles sont livrées dans le cytoplasme, un champ magnétique peut exercer une force magnétique sur plusieurs microbilles simultanément à haut débit. Le champ magnétique n’influence pas les fonctions cellulaires47, mais génère une force de pN à nN, ce qui est suffisant pour induire une déformation nucléaire 36,48,49. À ce jour, la manipulation de microbilles magnétiques a été appliquée sur la membrane plasmique cellulaire48, à l’intérieur du cytoplasme50, sur la F-actine51, à l’intérieur du noyau47 et sur le noyauisolé 36. Cependant, la manipulation magnétique des microbilles n’a jamais été utilisée pour appliquer une force mécanique directe sur l’enveloppe nucléaire afin d’étudier la mécanotransduction dans le noyau.

Dans cet article, une technique simple est développée pour délivrer de manière non invasive des microbilles magnétiques dans le cytoplasme et utiliser ces microbilles pour appliquer une force mécanique sur le noyau (Figure 1). Ici, des lignées cellulaires B2B humaines normales conçues par CRISPR / Cas9 qui expriment de manière endogène mNeonGreen21-10/11-marqué YAP sont utilisées pour valider la méthode. YAP est une protéine mécano-sensible, et la translocation de YAP est régulée par le mécano-détection nucléaire 14,28. L’approche knock-in régulée par CRISPR/Cas9 a été choisie pour marquer le YAP endogène avec une protéine fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Bien que l’édition CRISPR soit connue pour avoir une efficacité incomplète et un effet hors cible, les protocoles des publications précédentes ont intégré le tri par fluorescence pour sélectionner l’insertion correcte d’un cadre de lecture ouvert52,53,54. Avec cette couche supplémentaire de sélection, aucun événement de marquage hors cible n’a été observé dans 20+ lignées cellulaires précédemment générées52,53,54,55. Il s’agit d’une construction protéique fluorescente divisée, mais en principe, n’importe quelle étiquette fluorescente exprimable pourrait être utilisable. Cette approche de marquage est supérieure aux méthodes de transgène ou d’anticorps. Premièrement, contrairement à l’expression transgénique, la protéine marquée maintient le dosage du gène en une seule copie et s’exprime dans le contexte physiologique du réseau de régulation des gènes natifs, limitant ainsi les écarts dans la concentration, la localisation et l’interaction des protéines. La méthode de marquage utilisée dans cette étude permet d’atteindre un débit et une efficacité supérieurs d’un ordre de grandeur à ceux du marquage FP complet. Il évite également les défis associés à l’immunofluorescence en raison des artefacts de fixation et de la disponibilité limitée d’anticorps de haute qualité et de haute spécificité. Deuxièmement, l’approche utilisée dans cet article perturbe le moins possible la physiologie cellulaire et permet la révélation en temps réel de tous les YAP endogènes de manière authentique. En revanche, d’autres méthodes transgéniques courantes conduisent souvent à une surexpression de YAP. La distribution artificielle qui en résulte peut potentiellement provoquer une cytotoxicité et affecter la mécano-détection des cellules56,57,58.

Cette étude présente un protocole permettant d’appliquer directement une force sur le noyau par le biais de microbilles magnétiques introduites dans le cytoplasme et de réaliser simultanément une imagerie fluorescente de cellules vivantes. En résumé, les protocoles présentés ici démontrent comment (1) délivrer des microbilles magnétiques dans la cellule à l’extérieur du noyau, (2) manipuler les microbilles pour appliquer une force magnétique sur le noyau, (3) effectuer une imagerie confocale fluorescente des cellules pendant la manipulation et (4) analyser quantitativement le rapport nucléaire / cytoplasme YAP (N / C) tout au long du processus d’application de la force. Les résultats suggèrent que (1) par endocytose, les microbilles magnétiques peuvent être livrées de manière non invasive dans le cytoplasme des cellules B2B en 7 heures (Figure 2 et Figure 3); et (2) la force magnétique quantifiée directement appliquée sur le noyau (Figure 4, Figure 5 et Figure 6) seule peut déclencher divers changements du rapport YAP N/C dans les cellules B2B modifiées par CRISPR/Cas9 (Figure 7 et Figure 8).

Protocol

1. Maintenance des cellules B2B conçues par CRISPR/Cas9 Culture de cellules B2B dans une fiole T25 avec RPMI-1640 supplémentée avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine. Maintenir les cellules B2B dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2. Sous-culture des cellules B2B lorsque la confluence atteint 70% à 80%. Conservez la lignée cellulaire B2B dans un milieu de culture RPMI-1640 contenant 10 % (v/v) de DMSO dan…

Representative Results

Conception d’un dispositif de déplacement d’aimant et application d’une force magnétiquePour appliquer une force sur le noyau à travers les microbilles magnétiques, un dispositif de déplacement d’aimant a été conçu et construit pour contrôler la position spatiale de l’aimant. Le dispositif de déplacement de l’aimant contient un cadre central, trois boutons et des rails pour déplacer l’aimant attaché dans les directions x, y et z indépendamment à la résolution spatiale de …

Discussion

L’internalisation des microbilles magnétiques (section 2.2) est essentielle parce que les microbilles extracellulaires ne peuvent pas appliquer de force directement sur le noyau. L’application de force et l’imagerie (section 5.3) sont des étapes critiques dans cette expérience, et la force nécessaire pour déformer le noyau et induire des conséquences biologiques significatives pourrait dépendre de l’échantillon. L’amplitude de la force dans cette expérience (0,8 nN et 1,4 nN) peut encore être augment?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet est financé par UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), le UFHCC Pilot Award (X. T. et Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) et UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Nous apprécions sincèrement les discussions intellectuelles et le soutien technique du Dr Jonathan Licht (UFHCC), du Dr Rolf Renne (UFHCC), du Dr Christopher Vulpe (UFHCC), du Dr Blanka Sharma (BME), du Dr Mark Sheplak (MAE & ECE), du Dr Daniel Ferris (BME), du Dr Malisa Sarntinoranont (MAE), du Dr Ashok Kumar (MAE), du Dr Benjamin Keselowsky (BME), du Dr Brent Gila (RSC), du Dr Philip Feng (ECE), Dr Gregory A. Hudalla (BME), Dr Steven Ghivizzani (OSSM), Dr Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr Roger Fillingim (CD-BS), Dr Robert Caudle (OMS), Dr John Neubert (DN-OR), Dr Justin Hiliard (neurochirurgie), Dr Tian He (Université Harvard), Dr Youhua Tan (Université polytechnique de Hong Kong), Dr Jessie L-S Au (Institut de pharmacologie des systèmes quantitatifs), Dr David Hahn (Université de l’Arizona), et l’équipe de soutien de Nikon (Drs Jose Serrano-Velez, Larry Kordon et Jon Ekman). Nous sommes profondément reconnaissants pour le soutien efficace de tous les membres des laboratoires de recherche de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann et Guan et de tous les membres du personnel du département UF MAE.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in ‘omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -. F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

3D Magnetic Force ActuatorMulti-functional Fluorescence ImagingNucleus MechanobiologyMagnetic MicrobeadsCell InternalizationConfocal Fluorescence ImagingLive-cell ImagingNuclear StainYES-associated Protein (YAP)Cell BoundaryCytoskeletonOptical TweezersCell FunctionsHigh Throughput
check_url/64098?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image