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Biology

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
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1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Este estudo apresenta um novo protocolo para aplicar diretamente força mecânica no núcleo celular através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas.

Abstract

Uma questão fundamental na mecanobiologia é como as células vivas sentem estímulos mecânicos extracelulares no contexto da fisiologia e patologia celular. Acredita-se que a sensação mecano-celular de estímulos mecânicos extracelulares seja através dos receptores de membrana, do complexo proteico associado e do citoesqueleto. Avanços recentes na mecanobiologia demonstram que o núcleo celular no próprio citoplasma pode sentir independentemente estímulos mecânicos simultaneamente. No entanto, falta uma compreensão mecanicista de como o núcleo celular detecta, transduz e responde a estímulos mecânicos, principalmente por causa dos desafios técnicos no acesso e quantificação da mecânica do núcleo por ferramentas convencionais. Este artigo descreve o projeto, fabricação e implementação de um novo atuador de força magnética que aplica estímulos mecânicos 3D precisos e não invasivos para deformar diretamente o núcleo celular. Usando células modificadas por CRISPR/Cas9, este estudo demonstra que esta ferramenta, combinada com imagens fluorescentes confocais de alta resolução, permite a revelação da dinâmica em tempo real de uma proteína associada ao sim (YAP) mecanósquia em células individuais em função da deformação do núcleo. Este método simples tem o potencial de preencher a lacuna tecnológica atual na comunidade de mecanobiologia e fornecer respostas para a lacuna de conhecimento que existe na relação entre a mecanotransdução do núcleo e a função celular.

Introduction

Este estudo tem como objetivo desenvolver e aplicar uma nova técnica para elucidar a mecanobiologia do núcleo, combinando os atuadores magnéticos que aplicam força mecânica diretamente no núcleo celular e a microscopia de fluorescência confocal que simultaneamente visualiza as alterações estruturais e funcionais subcelulares. As células detectam sinais biofísicos extracelulares, incluindo rigidez tecidual 1,2,3,4, pressão do fluido intersticial e tensão de cisalhamento 5,6,7, topologia/geometria da superfície 8,9,10,11,12 e tensão de tensão/compressão13,14, 15,16. Os sinais biofísicos são convertidos em sinais bioquímicos e desencadeiam potenciais alterações a jusante da expressão gênica e dos comportamentos celulares – um processo conhecido como mecanotransdução 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Para estudar os processos de mecanotransdução, uma infinidade de técnicas foram desenvolvidas para aplicar força mecânica nas células, como microscopia de força atômica28, dispositivo de alongamento celular29, sensor de força bio-MEMS (sistemas microeletromecânicos) 15,30,31, reologia de cisalhamento 32 e Sistema de Visão Estéreo 33 . Uma revisão recente resume as abordagens para aplicar pistas mecânicas extracelulares e interferir no mecananosense34. Até o momento, a maioria desses métodos aplica força na membrana plasmática celular, e as células recebem diretamente esses sinais biofísicos extracelulares por meio de receptores de membrana, como integrina, caderina, canais iônicos e receptores acoplados à proteína G. Posteriormente, eles transmitem o sinal para o citoesqueleto e núcleo intracelular. Por exemplo, usando a translocação de proteína associada ao sim (YAP) como um indicador de mecanosensoriamento, as células mostram sentir os sinais mecânicos de rigidez do substrato e tensão extracelular da membrana celular e transmiti-los através do citoesqueleto para o núcleo para induzir a translocação citoplasma para núcleo YAP28,35.

Evidências recentes sugerem que o próprio núcleo celular é um mecano-sensor independente 8,36,37. Isso é comprovado por experimentos realizados no núcleo isolado colhido de células, onde foi revelado que os núcleos mudam adaptativamente sua rigidez em resposta à força mecânica diretamente aplicada sobre eles36. Durante muitas condições fisiológicas, os núcleos em células tumorais e saudáveis detectam sinais biofísicos extracelulares e alteram suas propriedades mecânicas e montagens38,39,40. Por exemplo, após o extravasamento, a rigidez nuclear das células tumorais diminui e mantém a maciez por mais de 24 h38. Durante a migração através do espaço intersticial confinado, os núcleos das células tumorais frequentemente perdem e recuperam sua integridade estrutural39. No entanto, a forma como o núcleo detecta o sinal biofísico é desconhecida, embora várias proteínas do envelope nuclear e famílias de proteínas tenham sido encontradas envolvidas, como a lamina A / C e o ligador do complexo nucleoesqueleto e citoesqueleto (LINC)38,41. Assim, novos métodos não invasivos que podem aplicar força diretamente ao núcleo dissociarão o efeito da transmissão de força da membrana plasmática celular e do citoesqueleto e ajudarão a elucidar os mecanismos moleculares anteriormente inacessíveis do mecanismo nuclear.

Pesquisas que empregaram pinças ópticas para manipular organelas42 e microesferas injetadas nas células43 mostraram a capacidade tecnológica de aplicar diretamente força no núcleo. No entanto, a técnica óptica-pinça tem várias limitações: (1) pinças ópticas de baixo rendimento geralmente manipulam apenas uma célula ou microesferas de cada vez; e (2) o potencial fotodano e a temperatura artefato-deformação do nuclear requerem dezenas de pN36, e a potência necessária correspondente do laser é de cerca de 10 mW por pN44,45. Essa intensidade de laser é suficiente para desencadear fotodanos nas células e perturbar as funções celulares durante o experimento46.

A força magnética aplicada através de microesferas dentro de células vivas mostra o potencial de aplicar força diretamente no núcleo e supera as limitações das pinças ópticas. Uma vez que as microesferas são entregues no citoplasma, um campo magnético pode exercer uma força magnética em várias microesferas simultaneamente de uma maneira de alto rendimento. O campo magnético não influencia as funções celulares47, mas gera força de pN a nN, o que é suficiente para induzir a deformação nuclear 36,48,49. Até o momento, a manipulação de microesferas magnéticas tem sido aplicada na membrana plasmática celular48, no interior do citoplasma50, na actina F51, no interior do núcleo47 e no núcleo isolado36. No entanto, a manipulação magnética de microesferas nunca foi usada para aplicar força mecânica direta no envelope nuclear para estudar a mecanotransdução no núcleo.

Neste trabalho, uma técnica simples é desenvolvida para entregar microesferas magnéticas no citoplasma de forma não invasiva e usar essas microesferas para aplicar força mecânica no núcleo (Figura 1). Aqui, linhagens celulares B2B humanas normais projetadas por CRISPR/Cas9 que expressam endogenamente o YAP marcado com mNeonGreen21-10/11 são usadas para validar o método. A YAP é uma proteína mecano-sensível, e a translocação da YAP é regulada pela detecção mecânica nuclear14,28. A abordagem knock-in regulada por CRISPR/Cas9 foi escolhida para marcar YAP endógeno com uma proteína fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Embora a edição CRISPR seja conhecida por ter eficiência incompleta e efeito fora do alvo, os protocolos em publicações anteriores integraram a classificação por fluorescência para selecionar a inserção correta do quadro de leitura aberta52,53,54. Com essa camada adicional de seleção, nenhum evento de marcação fora do alvo foi observado em mais de 20 linhagens celulares geradas anteriormente52,53,54,55. Esta é uma construção de proteína fluorescente dividida, mas, em princípio, qualquer tag fluorescente expressável poderia ser utilizável. Esta abordagem de marcação é superior aos métodos transgênicos ou de anticorpos. Primeiro, ao contrário da expressão transgênica, a proteína marcada mantém a dosagem do gene de cópia única e se expressa no contexto fisiológico da rede reguladora de genes nativos, limitando desvios na concentração, localização e interação da proteína. O método de marcação usado neste estudo alcança uma taxa de transferência e eficiência mais altas do que a marcação completa de FP. Também evita desafios associados à imunofluorescência devido a artefatos de fixação e à disponibilidade limitada de anticorpos de alta qualidade e alta especificidade. Em segundo lugar, a abordagem usada neste artigo faz uma perturbação mínima para a fisiologia celular e permite a revelação em tempo real de todos os YAPs endógenos autenticamente. Em contraste, outros métodos transgênicos comuns muitas vezes levam à superexpressão de YAP. A distribuição artificial resultante pode potencialmente causar citotoxicidade e afetar a detecção mecanogênica das células56,57,58.

Este estudo apresenta um protocolo para aplicar diretamente força sobre o núcleo através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas. Em resumo, os protocolos aqui apresentados demonstram como (1) entregar microesferas magnéticas na célula enquanto estão fora do núcleo, (2) manipular as microesferas para aplicar força magnética no núcleo, (3) realizar imagens fluorescentes confocais das células durante a manipulação e (4) analisar quantitativamente a relação YAP nuclear/citoplasma (N/C) durante todo o processo de aplicação da força. Os resultados sugerem que (1) através da endocitose, as microesferas magnéticas podem ser entregues de forma não invasiva no citoplasma das células B2B dentro de 7 h (Figura 2 e Figura 3); e (2) a força magnética quantificada aplicada diretamente no núcleo (Figura 4, Figura 5 e Figura 6) isoladamente pode desencadear diversas alterações da relação N/C YAP em células B2B projetadas por CRISPR/Cas9 (Figura 7 e Figura 8).

Protocol

1. Manutenção de células B2B projetadas por CRISPR/Cas9 Cultura de células B2B em frasco T25 com RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Manter as células B2B em incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2. Subcultura das células B2B quando a confluência atingir 70% a 80%. Armazenar a linhagem celular B2B em meio de cultura RPMI-1640 com 10% (v/v) de DMSO em um freezer de -80 °C. Use as c…

Representative Results

Projeto de um dispositivo de movimento magnético e aplicação de força magnéticaPara aplicar força no núcleo através das microesferas magnéticas, um dispositivo de movimento magnético foi projetado e construído para controlar a posição espacial do ímã. O dispositivo de movimento magnético contém uma estrutura central, três botões e trilhos para mover o ímã conectado nas direções x, y e z independentemente na resolução espacial de 1,59 mm por ciclo (Figura …

Discussion

A internalização das microesferas magnéticas (secção 2.2) é crítica porque as microesferas extracelulares não podem aplicar força diretamente ao núcleo. A aplicação de força e a imagem (secção 5.3) são etapas críticas nesta experiência, e a força necessária para deformar o núcleo e induzir consequências biológicas significativas pode ser dependente da amostra. A magnitude da força neste experimento (0,8 nN e 1,4 nN) pode ser aumentada ainda mais para desencadear a detecção de mecano nuclear em c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projeto é financiado pelo UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), o UFHCC Pilot Award (X. T. e Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) e UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Agradecemos sinceramente as discussões intelectuais e o apoio técnico do Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurocirurgia), Dr. Tian He (Universidade de Harvard), Dr. Youhua Tan (Universidade Politécnica de Hong Kong), Dr. Jessie L-S Au (Instituto de Farmacologia de Sistemas Quantitativos), Dr. David Hahn (Universidade do Arizona), e Equipe de Suporte da Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Estamos profundamente gratos pelo apoio efetivo de todos os membros dos laboratórios de pesquisa de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann e Guan e todos os membros da equipe do Departamento de MAE da UF.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
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Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
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